技术文章
Technical articles 药敏实验方法
1.实验材料:
1.1培养基:如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦康凯培养基,做沙门氏菌可选择SS培养基,巴氏杆菌可选择血液琼脂。
1.2药敏试纸:购买、自制或厂家提供
1.3细菌:从病鸡病变部位提取,如肝脏、心脏、脾脏等脏器。
1.4接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯
1.5移液器、滴头
2.实验准备:
2.1药敏片的准备:自制
2.1.1药敏片的制备:取定性滤纸,用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片,取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中,瓶口以单层牛皮纸包扎,经15磅15-20分钟高压消毒后,放在37℃温箱或烘箱中数天,使*干燥。
2.2.2抗菌药纸片制作:在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液适量,并翻动纸片,使各纸片充分浸透药液,翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称,放37℃温箱内过夜,干燥后即密封,切勿受潮,置阴暗干燥处存放,有效期3-6个月。
2.2药液的制备(用于商品药的试验):按商品药治疗量3-5倍比例配制药液;如治疗量为1L水加1g药,配制药液时就是1g加200-300ml水或1L水加3-5g药,及配制药敏片所用的药液。
3.实验操作方法:
3.1药敏片法
3.1.1在“超净台”(或自制无菌操作台)中,用(酒精灯)经火焰灭菌的接种环从病料中挑取适量细菌培养物,以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式:用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌,以每点开始划线涂菌至平皿的1/2,然后找到第二点划线至平皿的1/2,依次划线,直至细菌均匀密布于平皿。(另:可将待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液,将少量混悬液倒入平皿培养基上,轻晃平皿使铺匀,放置5-10min)。
3.1.2将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停,取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴,可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果,要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上,一般可在平皿中央贴一片,外周可等距离贴若干片(外周一般可贴4-5片),每种药敏片的名称要记住。
3.1.3将平皿培养基倒置放于37℃温箱中培养24小时后,观察效果。
4.结果观察:
在涂有细菌的琼脂平板上,抗菌药物在琼脂内向四周扩散,其浓度呈梯度递减,因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈,抑菌圈越大,说明该菌对此药敏感性越大,反之越小,若无抑菌圈,则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。
5.判定标准:
5.1药敏实验的结果,应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。
表1 药物敏感实验判定标准
抑菌圈直径(毫米) | 敏感度 |
20以上 | 极敏 |
15-20 | 高敏 |
10-14 | 中敏 |
10以下 | 低敏 |
0 | 不敏 |
5.2 药物敏感实验判定标准参考表1,抑菌圈直径在15毫米以上为高敏,10毫米以下为低敏,无抑菌圈为不敏。
6.影响药敏结果的因素:
6.1培养基:应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时,厚度合适(约5-6mm),不可太薄,一般90mm直径的培养皿,倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质,如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性,胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸(PABA)能拮抗磺胺药和TMP的活性。
6.2细菌接种量:细菌接种量应恒定,如太多,抑菌圈变小,能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
6.3药物浓度:药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果,需配制。
6.4培养时间:一般培养温度和时间为37℃、12-24小时,有些抗菌药扩散慢如多粘菌素,可将已放好抗菌药的平板培养基,先置4℃冰箱内2-4小时,使抗菌药预扩散,然后再放37℃温箱中培养,可以推迟细菌的生长,而得到较大的抑菌圈。
7.应用
药敏实验后,应选择高敏药物进行治疗,也可选用两种药物协助使用,以减少耐药菌株。选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径,因为我们药敏实验是药液直接和细菌接触,而在给禽用药的时候,必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果,所以在给禽用药时,高敏药物一定要配合适宜的给药方法,这样才会达到好的治疗效果。
附表2 山东省2004年1-5月份大肠杆菌和沙门氏菌常用药物敏感程度参考表
药物 | 大肠杆菌 (细菌) | 沙门氏菌(细菌) | ||||||
QD-1(菌株) | LC-5 | JN-7 | LY-1 | RZ-5 | QD-2 | JN-8 | LY-1 | |
新霉素 | 20(抑菌) | 18 | 14 | 25 | 26 | 23 | 18 | 16 |
先锋必 | 28 | 26 | 30 | 29 | 32 | 33 | 31 | 26 |
氟苯尼考 | 22 | 21 | 14 | 18 | 30 | 28 | 24 | 21 |
庆大霉素 | 15 | 0 | 0 | 12 | 19 | 17 | 12 | 12 |
诺氟沙星 | 10 | 12 | 13 | 12 | 20 | 20 | 11 | 21 |
氧氟沙星 | 12 | 13 | 13 | 11 | 23 | 22 | 15 | 12 |
先锋五号 | 19 | 23 | 20 | 18 | 28 | 26 | 21 | 22 |
蒽诺沙星 | 12 | 14 | 15 | 13 | 20 | 16 | 13 | 16 |
丁胺卡那 | 17 | 19 | 12 | 22 | 32 | 30 | 14 | |