器材和试剂]
● PCR试剂和设备
● 1ug任何舍有scFv及(GIy4Ser)3接头的载体
● RHuJH引物、RHuVκ引物和RHuVλ引物,10pmol/ul
[方法]
1.在0.5ml微量
离心管内配制用于扩增的主混合液。所显示的主混合液用于V
H—Vκ接头。对于V
H—Vλ接头的主混合液,n=29。
单个反应主混合液/ul (n=25)
● 水 37 925
● 10×Vent缓冲液 5.0 125
● 20×dNTPs 2.5 62.5
● Vent DNA聚合酶 0.5 12.5
2.取24支0.5ml试管,每管分别加入RHuJH引物和RHuVκ引物,各2ul。RHuJH引物和RHuVκ引物共有24种可能的结合形式。而对于VH—Vλ接头,则用RHuVl引物替代RHuVκ引物即可,共可编为28管。如无加热盖,可以加入l滴轻质矿物油覆盖反应液。
3.设1个阴性对照管,加入50ul主混合液。
4.每个样本取1.0ul scFv基因模板(约1ng),加入到主混合液中。
5.取46u1主混合液分别加入到步骤2已制备的24个管内。
6.预加热PCR反应格到94℃。
7.以94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃1分钟的条件共循环25次,扩增接头序列。
8.将PCR产物用2.0%TBE琼脂糖胶电泳纯化,切取PCR产物;用Geneclean抽提,并重悬DNA于50ul水中。
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