氟金检测方案及使用指南

1. 背景 Fluoro-Gold的使用原理与其他荧光示踪剂基本相同。主要区别在于，Fluoro-Gold在注射后存活时间、浓度 范围、组织处理方式以及与其他组织化学技术的兼容性方面更具灵活性。 

2. 储存与保质期 Dry Fluoro-Gold 应储存于避光、密封的容器中，温度保持在 4 摄氏度。正确储存条件下，Fluoro-Gold 的保质期应超过一 年。溶液中的染料亦应储存于避光、密封的容器中，温度保持在 4 摄氏度；在此条件下，其稳定性至少可维持六个月。 

3. 车辆 氟金可溶于蒸馏水或0.9%生理盐水，亦可作为0.2M中性磷酸盐缓冲液中的悬浮液使用。 

4. 染料浓度 氟金（Fluoro-Gold）已在1%-10%的浓度范围内成功应用。初始推荐浓度为4%。若注射部位出现不良坏死 反应或标记信号过强，应将浓度降至2%溶液。如需进行更精确的测量，需知氟金的分子量为532.6道尔顿。 

5. 染料给药 A. 压力注射——这可能是常用的给药方式。注射体积范围为0.05–1 µl ，通常为0.1–0.2 µl 。 B. 离子电渗疗法——通过4-10秒的脉冲式离子电渗治疗（电流强度为+5至+10微安/10分 钟），可形成离散的小型注射点。 C. 晶体——示踪剂晶体可通过微吸管尖部进行给药。 

6. 术后生存期 已观察到良好的逆行标记效果，其持续时间范围从两天至两个月不等。典型的存活期为三至五天。较长的 存活期可增强远端突起的染色填充效果，同时避免染料从细胞中扩散。 

7. 固定；注视 几乎任何固定剂均可使用，亦可不使用固定剂；通常采用含4%甲醛的磷酸盐中性缓冲盐水。含有高浓度重 金属（如锇、汞）的固定剂会淬灭荧光信号，而高浓度（超过1%）的戊二醛则可能增强背景荧光。 

8. 组织化学处理 含有荧光金的组织可采用几乎所有常见的组织学技术进行处理。这包括未固定的组织冷冻切片（10 µ m）、固定的组织冷冻切片（20 µm），以及从包埋于塑料（0.2–4 µm）或石蜡（3–10 µm）中的组织切 制的薄切片。其中，固定的组织冷冻切片最为常用。 

9. 组合方法 在这一处理阶段，样本切片可进一步进行第二种标记技术处理，例如放射自显影、 HRP 组织化学、免疫细胞化学、 第二种荧光示踪剂或荧光复染等。 

10. 安装、清理和覆盖 切片通常固定于明胶包被的载玻片上，经空气干燥后浸入二甲苯中，并用非荧光 DPX 塑料封片剂进行封 片。除非与第二种示踪剂不兼容，否则切片可采用梯度酒精进行脱水处理。若需将荧光金技术与荧光免 疫细胞化学技术联用，则切片经空气干燥后直接用中性缓冲甘油（1:2）进行封片。 

11. 检查与摄影 氟金可通过荧光显微镜并使用宽带紫外激发滤光片进行观察。当组织经中性pH缓冲液处理后会发出金色荧光，而组织经其 他处理时则会发出蓝色荧光。该样本采用酸性（例如pH 3.3）pH缓冲液进行处理。可采用数字方式或胶片进行拍摄（彩色打印使用Ektachrome 200-400 ASA胶片，黑白打印则使用同等感光度的胶片，例如Tri-X）。曝光时间通常为10至60秒， 具体取决于物镜放大倍数和标记物的强度；30秒的曝光时间约为平均值。可通过多次曝光同时观察荧光金 与其他示踪剂。因此，在放射自显影技术中，可将紫外光与明场照明结合，同时定位荧光金与 HRP 或银颗 粒；同样，蓝光激发可同时显示FITC的绿色发射信号，而绿光激发则可用于同步观察碘化丙啶或溴化乙锭 （一种荧光复染剂）的红色发射信号。 

关于氟金应用的补充信息 

车辆 对于通过微量注射器或微管进行的压力注射，氟金（Fluoro-Gold）应溶解于蒸馏水中。 .9%生理盐水。氟金也可作为悬浮液使用于0.2M中性磷酸盐缓冲液中，但悬浮颗粒可能堵塞精细微量移液 管尖部，因此蒸馏水或0.9%生理盐水是更优选的载体。对于离子电渗疗法，需将1%氟金溶液配制于0.1M 乙酸缓冲液（pH=3.3）中。经过清洗（95% ETOH ，水）的玻璃微量移液管尖部直径应为10-20 µ m 。最佳离子电渗参数为：以脉冲电流（通电4-10秒，断电4-10秒）施加+1至+5微安电流，持续时间 10-20分钟。 

注射部位 几乎任何中枢或周围神经系统结构均可注射氟金（Fluoro-Gold）以用于逆行运输分析。在周围神经系统 中，可对神经节及周围靶点进行研究。进行周围神经研究时，需切断或损伤神经，并将其浸入或注射含5% 氟金水溶液。由于氟金不会被完整的传导纤维显著摄取，因此必须切断或严重损伤纤维才能实现染料的摄 取。 

运输与存活时间 氟金（Fluoro-Gold）被用作逆行性轴突示踪剂，尽管顺行性轴突运输确实会发生。应调整其存活时间（尤 其是缩短至12小时至2天），以在所研究的特定神经元系统中顺行性运输效率。对于逆行性运输，存 活时间应调整为4天至14天。对于大多数系统而言，7至10天即可满足需求；然而，较长的神经通路（例如 从脊髓到脑干）以及大型哺乳动物（如猫、猴）的通路可能需要更长的存活时间（例如14天）。此外，由 于氟金在逆行标记的神经元内分布迅速，数月的存活时间同样能获得优异效果。对于离子电渗法，推荐采 用2至5天的存活时间。据估计，哺乳动物的运输速度约为每天2厘米；而冷血动物的运输速度较慢。 

组织处理 组织处理方法在使用指南及原始出版物（Schmued and Fallon，1986，Brain Research 377:147-154）中均有 详细说明。由于荧光金在多种溶剂中均具有稳定性，且在逆行标记的神经元内保持快速分布特性，其应用 兼容多种组织化学技术。该技术可与其他逆行追踪剂、免疫荧光法、PAP与ABC免疫细胞化学法、 HRP 组织化学法、放射自显影技术、复染法（选择溴化乙锭作为荧光复染剂）、石蜡包埋及塑料包埋技术共同 使用。然而，若组织未经固定，需在水性溶液中进行超过一至两小时的额外处理，会导致标记神经元中的 荧光金荧光信号消失。荧光金在电子显微镜观察中具有应用价值；其亦可用于已切片并转移至磷酸盐缓冲 液中的脑组织样本。切片通常固定于明胶包被的载玻片上，经空气干燥后浸入二甲苯中，并用 DPX 塑料 封片剂进行封片。组织也可直接在载玻片上观察而无需进一步处理；也可通过梯度酒精进行脱水处理；对 于免疫细胞化学检测，切片可经空气干燥后直接用中性缓冲甘油（1:2）进行封片。 

检查与摄影 荧光金需使用配备宽波段紫外（UV）激发滤光片的荧光显微镜进行观察。应采用与其他宽波段紫外激发的 荧光逆行示踪剂（如True Blue、Fast Blue、Nuclear Yellow）相同的滤光片组，例如Leitz Phloem滤光系统A （宽波段UV，激发滤光片BP 340-380）、Mirror RKP 400、Barrier Filter LP 430）。载物台应专门用于荧光 显微镜（如蔡司品牌产品），材质可选用甘油或水。由于塑料会吸收紫外光，不建议通过塑料培养皿等介 质观察样本。推荐使用的胶片为T-Max（柯达，黑白）和Ektachrome 200（柯达，彩色）。曝光时间通常为 20秒至1.5分钟