针对治疗性单克隆抗体下游纯化捕获环节存在载量低、填料循环寿命短、宿主杂质去除效果差等问题，以 Cytiva MabSelect 全系列 Protein A 树脂为研究对象，系统对比 MabSelect、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX、MabSelect PrismA 四种介质的基质结构、动态结合载量、耐碱清洗能力与杂质清除性能。以 CHO 细胞表达 IgG1 型单抗发酵上清为原料，构建平衡 - 多级洗涤 - 酸性洗脱 - 酸洗剥离 - 在位清洗（CIP）标准化层析工艺，通过单因素试验优化上样 pH、洗脱 pH、洗涤盐浓度、CIP 碱浓度等关键工艺参数。结果显示：MabSelect PrismA 综合性能，6 min 停留时间下动态载量可达 80 mg IgG/mL 树脂，最高耐受 1.0 mol/L NaOH 在位清洗，稳定循环 200 次以上；优化后的两级梯度洗涤体系可去除 93% 以上宿主蛋白（HCP），单抗总回收率≥90%，洗脱单体纯度＞95%，宿主 DNA 残留＜10 pg/mg，Protein A 配基泄漏＜5 ng/mg 抗体。该套工艺适配实验室小试、中试放大与商业化生产线，可用于完整 IgG、Fc 融合蛋白、双特异性抗体纯化，为抗体药物下游捕获平台工艺开发提供标准化技术方案。

单克隆抗体药物是肿瘤、自身免疫性疾病临床治疗的核心生物制剂，完整下游纯化流程分为亲和捕获、精细层析纯化、制剂缓冲液置换三大单元，其中 Protein A 亲和层析承担绝大部分宿主杂质去除工作，是决定产品纯度、生产成本的关键步骤。传统天然 Protein A 琼脂糖基质机械强度弱、耐碱性差、配基易水解脱落，动态载量偏低，仅能短期循环使用，难以适配高滴度补料发酵液大规模连续生产。

Cytiva 开发的 MabSelect 系列重组 Protein A 树脂采用无动物源稳定配基与高交联刚性琼脂糖骨架，形成四代梯度产品矩阵，分别适配基础科研、临床前中试、商业化大规模生产等不同应用场景。现有研究多针对单一型号树脂开展工艺摸索，缺少全系列树脂横向性能对比，同时缺少统一、可线性放大的标准化缓冲体系与分级 CIP 清洗方案。

本文系统表征 MabSelect 系列树脂理化与层析性能，建立通用缓冲液体系，系统优化关键工艺参数，评估填料循环稳定性与杂质去除能力，形成一套合规、低成本、可直接放大的单抗捕获工艺，为创新抗体药物下游工艺开发与申报提供完整数据支撑。

层析介质：MabSelect、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX、MabSelect PrismA（Cytiva 原装 50% 乙醇保护浆液）；HiTrap 5 mL 预装柱、Tricorn 5/50 层析柱。样品：CHO 细胞补料发酵上清，人源 IgG1 单抗，滴度 2.8 g/L，0.22 μm 水系滤膜过滤后备用。试剂：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、醋酸钠、Tris、NaCl、冰醋酸、CHAPS（色谱纯）；HCP ELISA 检测试剂盒、宿主 DNA 荧光定量试剂盒、CE-SDS 毛细管电泳试剂、蛋白定量试剂盒。耗材：0.22 μm 滤器、50 mL 无金属离心管、NanoTemper 检测毛细管。

ÄKTA avant 25 全自动蛋白纯化系统；NanoDrop 紫外分光光度计；高速冷冻离心机；pH 计、电导率仪；毛细管电泳仪；荧光定量 PCR 仪；动态光散射粒度仪。

1）动态结合载量测定：各型号树脂装填 1 mL Tricorn 层析柱，平衡缓冲液充分平衡，设置 2.4 min、4 min、6 min 三组停留时间上样发酵上清，实时监测 UV280 吸收曲线，以 10% 抗体穿透点计算 QB10 动态载量。2）耐碱循环稳定性测试：每次层析结束后采用不同浓度 NaOH 反向冲洗柱床 10 min，连续循环 150 次，每 30 次取样测定动态载量、Protein A 配基泄漏量，评价填料性能衰减程度。3）配基泄漏检测：收集全部洗脱组分，双抗夹心 ELISA 法定量游离 Protein A 含量。

1）平衡缓冲液：20 mM NaPi，150 mM NaCl，pH 7.4；2）高盐洗涤缓冲液：20 mM NaPi，500 mM NaCl，pH 7.0；3）弱酸预洗缓冲液：50 mM 醋酸钠，pH 6.0；4）洗脱缓冲液：50 mM 醋酸钠，pH 3.5；5）中和缓冲液：1 mol/L Tris-HCl pH 8.0（洗脱收集管预先添加，体积占洗脱液 5%）；6）酸洗剥离液：100 mM 醋酸，pH 2.9；7）分级 CIP 再生液：0.1 mol/L、0.5 mol/L、1.0 mol/L NaOH；8）填料保存液：20% 乙醇 - PBS 无菌溶液。

柱床体积 1 mL，流速 180 cm/h，停留时间 6 min；上样量控制为树脂动态载量 75%；完整流程：3 倍柱体积（CV）平衡→上样→5 CV 高盐洗涤→1 CV 弱酸预洗→3 CV 酸性洗脱→2 CV 酸洗剥离→3 CV CIP 碱液循环清洗→纯水中和→平衡保存。

以单抗回收率、HCP 残留、抗体单体纯度为评价指标，分别考察上样 pH（6.8、7.2、7.4、7.8）、洗脱 pH（3.2、3.5、3.8、4.2）、洗涤 NaCl 浓度（150、300、500、800 mM）、CIP 碱浓度对纯化效果的影响。

抗体浓度采用 UV280 定量，消光系数 E1%=13.7；HCP 采用 ELISA 试剂盒定量；宿主 DNA 采用 qPCR 检测；抗体纯度、单体比例采用 CE-SDS 分析；蛋白聚集采用动态光散射与 nanoDSF 联合检测；Protein A 泄漏采用 ELISA 定量。

表 1 MabSelect 系列树脂核心层析性能

停留时间显著影响动态载量：停留时间缩短至 2.4 min 时，PrismA 载量仍可达 65 mg/mL，适配快速连续层析；初代 MabSelect 载量下降超 30%，不适合高速生产。耐碱循环结果表明，PrismA 经 1.0 mol/L NaOH 连续 150 次循环后，动态载量仅下降 6.2%，配基泄漏＜5 ng/mg 抗体；初代 MabSelect 仅耐受 0.1 mol/L NaOH，同等循环下载量衰减 25% 以上，配基泄漏量提升 10 倍。

上样 pH 7.2~7.4 区间 IgG 与 Protein A 疏水、氢键结合作用强，抗体穿透量低，回收率稳定在 90% 以上；pH 低于 7.0 时分子间作用力减弱，抗体穿透流失，回收率下降 6%~10%；pH 高于 7.8 体系静电排斥增强，非特异性吸附杂蛋白增多，HCP 残留显著上升。确定优上样 pH 为 7.4。

仅使用 PBS 单一洗涤时，洗脱产物 HCP 残留＞1200 ng/mg；增加 500 mM NaCl 高盐洗涤后，疏水性宿主蛋白大量去除，HCP 降至 320 ng/mg；叠加 pH 6.0 弱酸预洗，解离弱结合杂蛋白与核酸杂质，HCP 降至 85 ng/mg，杂质去除率达 93% 以上，多级洗涤仅造成 1.2% 抗体回收率损失，除杂优势显著。

洗脱 pH 3.2 条件下抗体解离，回收率 92.5%，但长期酸性环境引发抗体不可逆聚集，单体比例仅 86.3%；pH 3.8 洗脱聚集程度大幅降低，单体纯度 96.8%，但洗脱不全，回收率降至 83.7%；综合平衡回收率与产品质量，优洗脱 pH 为 3.5，洗脱液收集后立即用 Tris 中和至中性，可稳定维持单体纯度 95% 以上。

初代 MabSelect 仅允许 0.1 mol/L NaOH 单次接触≤5 min，长期强碱清洗会造成配基水解脱落；SuRe、SuRe LX 系列可稳定使用 0.5 mol/L NaOH 清洗 10 min / 循环；PrismA 适配 1.0 mol/L NaOH 深度清洗，可有效去除脂质、蛋白沉积，同时实现病毒灭活。针对高脂质、高 HCP 发酵样品，采用 100 mM 硫代甘油预处理后再碱洗，填料使用寿命可提升 30%。

完整人源 IgG1/IgG2/IgG4 均可在全系列树脂上高效捕获，采用 PrismA 纯化回收率稳定 90%~93%；双特异性抗体优先选用 SuRe LX 与 PrismA，可通过梯度 pH 洗脱去除单臂副产物；Fab、VHH 等无 Fc 段抗体需搭配 MabSelect VH3 树脂配套纯化。

采用 MabSelect PrismA 与优化后标准化工艺处理 CHO 发酵上清，整体纯化指标：单抗总回收率 90.8%，洗脱单体纯度 95.6%，HCP 残留 82 ng/mg，宿主 DNA＜10 pg/mg，Protein A 配基泄漏 3.2 ng/mg，纯化产物各项指标满足离子交换、疏水层析精细纯化进料标准。

实验室小规模工艺筛选、低滴度样品纯化选用 MabSelect，采购成本低，满足基础研发需求；临床前中试、常规滴度发酵液优先 MabSelect SuRe，平衡载量与耐碱性能，循环寿命适中；高滴度补料发酵、大批量样品制备选用 MabSelect SuRe LX，加长间隔臂大幅提升动态载量，降低填料使用体积；商业化连续生产线、高杂质难纯化样品选择 MabSelect PrismA，超高载量搭配 1.0 mol/L NaOH 深度清洗，大幅降低填料更换成本与综合生产成本。

发酵上清必须经 0.22 μm 过滤，细胞碎片、脂质颗粒会堵塞树脂孔道，造成载量性下降；高脂质发酵液可添加 0.05% CHAPS 预处理去除脂类杂质，不干扰 IgG 与 Protein A 结合；高速连续生产选用 PrismA 可将停留时间缩短至 2.4~4 min，高聚集、高粘度抗体延长停留时间至 6 min，保证抗体分子充分扩散至树脂孔道；低 pH 洗脱液必须即时中和，避免抗体长时间酸性暴露引发聚集、电荷异质性升高；全套缓冲液与树脂配套 Cytiva 法规支持文件（RSF），碱洗 CIP 步骤同步实现病毒灭活，满足国内外新药申报合规要求。

MabSelect 系列刚性交联琼脂糖可耐受 300 cm/h 高流速，柱压低、无压缩，同等柱体积处理量为传统树脂 3~4 倍；SuRe 与 PrismA 耐碱改造配基，循环次数提升 2~4 倍，显著降低填料更换成本；配基单点稳定偶联，游离 Protein A 渗漏量降低 90%，减少下游去除配基的额外工序；整套缓冲体系通用，工艺可线性放大，从 1 mL 实验室小试柱直接放大至千升级工业层析柱，无明显工艺偏移。

本文系统完成 MabSelect 四代 Protein A 亲和树脂性能表征，建立一套标准化、可线性放大、合规的单抗捕获层析工艺，优化平衡、多级洗涤、酸性洗脱、分级 CIP 全套缓冲与操作参数。MabSelect PrismA 综合性能优，6 min 停留动态载量 80 mg IgG/mL，耐受 1.0 mol/L NaOH 在位清洗，稳定循环 200 次以上；两级梯度洗涤体系高效去除宿主蛋白、DNA、脂质杂质，单抗回收率≥90%，单体纯度＞95%。该工艺适配完整 IgG、Fc 融合蛋白、双特异性抗体等各类治疗性抗体，覆盖实验室研发、中试放大、商业化连续生产全场景，为生物制药下游捕获平台工艺开发提供标准化技术参考，可直接用于工艺申报、放大生产与质量控制体系搭建。