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更新时间：2026-07-21
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mRNA翻译的调控能快速调节蛋白质生成，并促进局部细胞对环境条件的响应。传统上，翻译的起始被认为是主要的翻译控制点，但肽延长的控制同样重要。本研究显示，在未被激活的CD8+ T细胞中，延长因子eIF5a的功能在翻译后修饰激活后动态调控，从而促进特定蛋白亚组的翻译。eIF5a对效应体CD8+ T细胞的长期存活至关重要，新生多肽的测序表明，调控增殖和关键效应蛋白功能的产生，尤其是IFNγ的产生，以及较轻的TNF产生和细胞毒性，依赖于功能性eIF5a的存在。多免疫细胞谱系中翻译的调控对于协调免疫反应至关重要，这些数据表明翻译延长有助于调节转录后调控，而这些调控对控制炎症至关重要。
学科术语：细胞生物学、RNA、细胞毒性T细胞、淋巴细胞激活、干扰素
翻译延长因子eIF5a可能在T细胞蛋白翻译中发挥作用。作者展示了eIF5a的上膛或缺失会改变T细胞中mRNA翻译的谱，且eIF5调控这些T细胞的增殖和效应功能。
在核糖体生成和翻译层面调控蛋白质表达，可以快速重塑并协调对环境变化的反应。在包括干细胞1和T淋巴细胞2在内的多种细胞类型中，已记录出转录组与蛋白质组之间的差相关性，表明其蛋白质产生中有相当一部分受到翻译调控。这两种谱系都可能在环境触发条件下经历快速扩展和细胞身份变化3.核糖体生物合成的调控和全球mRNA翻译3共同促成了这种可塑性，同时还有更具靶向性的转录后调控，这对于指导具有相关功能或参与共同生物通路的蛋白质生成至关重要4。调控这些mRNA子集通常涉及与RNA结合蛋白或非编码RNA（如miRNA和lncRNA）的相互作用5,6。此外，核糖体成分或参与mRNA翻译的蛋白质的变化也会影响蛋白质的产生。我们表明，对于初生的CD8+ T细胞，核糖体生物合成程度受到T细胞受体（TCR）激活程度的显著影响，这不仅影响了蛋白质群的整体翻译，也对蛋白质群的选择性影响7。这种翻译控制的可塑性如何围绕核糖体运作尚不清楚，但在翻译8,9过程中，许多蛋白质直接参与核糖体，这些蛋白质本身可能在翻译和翻译后都受到调控。其中一种蛋白是翻译因子eIF5a，它是CD8+ T细胞中丰富的20种蛋白质之一。eIF5a最初被鉴定为翻译起始因子，但也可能在蛋白质11的特定子集的翻译延长和终止10中发挥作用。特别是，eIF5a对于连续脯氨酸残基间高效肽键形成至关重要，并可能影响甘氨酸和带电氨基酸的翻译10,12，表明它在影响转录后调控子中起着重要作用。
真核生物和古菌中的eIF5a异构体是在Lys50-51 13上翻译后附着于hypusine残基的蛋白质，这一修饰对eIF5a功能14至关重要。上层酶化部位与80S核糖体上的P位tRNA受体干接触，未修饰的eIF5a在促进肽合成方面效率低下，而抑制酶化途径则损害了哺乳动物细胞中的增殖17,18。孢瓜明是一种天然多胺，是eIF5a催眠的供体基，在衰老细胞中还原。膳食补充的精瓜胺恢复了eIF5a高密度和T细胞功能中与年龄相关的损伤，并延长了酵母菌、苍蝇、蠕虫和培养人类PBMCs的寿命20。因此，强有力的证据将eIF5a的过室化丰度及其在年龄相关免疫衰老中的作用联系起来。
本研究的目的首先是确定eIF5a本身在T淋巴细胞中的活性如何被调控，其次是eIF5a是否在T细胞激活过程中选择性调控特定mRNA子集的翻译。我们使用对eIF5a本身及其催眠所需的专用酶——脱氧氢化酶（DHPS）和脱氧高血质羟化酶（DOHH）的CRISPR敲除，并比较了敲除效果与脱氧氢化酶抑制剂GC7对催化的影响。我们表明，原始T细胞表达丰富的eIF5a，但其处方酶修饰有限，暗示功能受限。激活后，eIF5a蛋白的产生上调，DHPS和DOHH酶表达，使得高管化型eIF5a更为丰富。eIF5a的丧失意外地增加了部分核糖体蛋白、翻译延长因子eEF1成分以及可能的翻译抑制剂eIF6的产生，同时减少了翻译启动因子eIF3和eIF5的成分，表明mRNA翻译机制的组成发生了变化。对eIF5a敲除T细胞中新生肽产生进行质谱分析，证实在没有eIF5a的情况下，特定蛋白组的合成影响不均，尤其是参与细胞周期调控和细胞因子产生的蛋白，其中对IFNγ产生影响最为深远。这些急性变化伴随着细胞长期存活失败。GC7治疗未能忠实复现DHPS和DOHH敲除细胞的表型，表明该药物存在显著的非靶向影响。总体数据与eIF5a协调T淋巴细胞转录后调控子及原级T细胞功能一致。
T细胞的一个独特特征是它们作为天真细胞存在时间较长，功能未成熟、不分裂且代谢惰性，大分子合成水平极低。在通过抗原特异性TCR刺激后，它们会迅速启动基因转录和蛋白质合成。刺激后最初24小时内，CD8+ T细胞质质量增加约4倍，表明大分子合成的快速启动，随后开始短达2–4小时的增殖爆发22,23。
我们研究了表达单一特异性转基因TCR的OT-1 CD8+ T细胞中eIF5a的功能成熟，该细胞识别来自鸡卵白蛋白的肽SIINFEKL。来自原始OT-1 T细胞的细胞裂解物的西方印迹显示eIF5a表达丰富，但具有低浓度的氢酶特异性抗体信号较低（见图。1a，b）。活化后，高管酶化的eIF5a丰度增加了~3倍，同时DHPS表达也随之增加，DHPS是催化将4-氨基丁基细胞转移至eIF5a的酶。被高管化的eIF5a和DHPS丰度均在24-48小时内达到峰值，比对照蛋白ZAP-70增加~2倍。利用流式细胞术测量高管化和总eIF5a的单细胞检测（图。1c， d）证实了西部印迹和hypusine，eIF5a丰度显示增加了4小时。染色在24小时达到峰值，高水化增加了~7倍，总eIF5a增加了4倍，相较于总eIF5a，高出1.5-2倍的低素素，这使得新合成和已有的eIF5a池都可能被高化。3此前研究表明，H-精苘在活化人类淋巴细胞时能通过氢化改造标记单个蛋白13。该蛋白后来被鉴定为eIF5a（之前称为eIF-4D24），并且是真核生物蛋白质组中携带hypusine修饰的蛋白质
在指示时间内用激动剂肽SIINFEKL刺激了一颗Naïve OT-1淋巴结CD8+ T细胞，并用Abs探测了DHPS、羟基氨酸、eIF5a和ZAP70作为负荷控制的总细胞裂解液的western印迹，并在每个通道中装入相等细胞数。b 在与同一时间点的ZAP70强度进行归一化后，相对于0小时时间点计算了折叠上调和和Hyp：eIF5a比值。图中展示了三个独立实验的一个代表。左侧面板的线条：红色，Hyp-pAb;蓝色，DHPS;绿色：eIF5a。右侧面板的线条：红色，实验1;蓝色，实验2。c 流式细胞术分析显示，OT-1细胞被Abs染色，针对eIF5a和hypusine。4小时时染色较亮的小峰值可能是细胞聚集的假象，单细胞门控策略无法排除。线条：灰色阴影，0 h;浅蓝色，4小时;绿队，8小时;红色，24小时;深蓝色，48小时。显示了两个独立流式细胞术实验的相对平均荧光强度（MFI），并用于计算右侧的Hyp：eIF5a比值。左侧面板的线条：浅红和深红，分别是实验1和2中的Hypusine;分别在实验1和2中使用浅蓝色和深蓝色，eIF5a。右侧面板的线条：红色，实验1;蓝色，实验2。
eIF5a的上液化有助于高效促进体外翻译延长，16，并可能负责其细胞质定位25。然而，目前尚不清楚非高管化前体和去氧高氨酸化中间体eIF5a是否在原级细胞中具有活性。这个问题很重要，因为靶向DHPS或DOHH作为抑制eIF5a的方法，可能不是最佳策略，因为出芽酵母DOHH的缺失仅有轻度表型26，而胚胎靶向DOHH在小鼠中则致死性为27。许多研究利用药物GC7抑制高激活和eIF5a的功能。GC7是一种精瓜胺衍生物，与沙瓜咪定竞争结合DHPS，阻止未高管化的eIF5a前体转化为其脱氧高管酶中间体，但尚不清楚GC7是否具有抑制eIF5a以外的作用。
初生的OT-1 T细胞被激活2天，然后用GC7处理2天或转染CRISPR-Cas9导引以破坏Eif5a、Dhps或Dohh基因。Eif5a为了大化细胞恢复，通常在细胞因子IL-2中进行3次培养后恢复KO细胞，而其他KO则可留至4D。时间程分析进一步显示，通过流式细胞术和针对特定蛋白的抗体测量的敲除表型变化（代表性门控策略见补充图）。1），与CRISPR靶向分子的丧失相关（补充图）。2a）。CRIPSR-Cas9转染对照针对表面分子Thy 1。鉴于靶向效率高为80%，同一培养中可通过细胞内染色分析eIF5a或尿素，以识别阳性细胞。图2a展示了一个代表性实验，Eif5a、Dhps和Dohh的平均KO百分比分别为38.4%、71.6%和78.9%。通过使用FACS分选的eIF5a阳性和阴性群体进行西方印迹法，确认了Eif5a KO细胞中eIF5a蛋白的耗竭（图）。2b）。eIF5a的耗竭已被证明影响细胞增殖11,28，这也反映在Eif5a KO细胞培养后的细胞恢复率显著低于对照Thy1 KO细胞。同样，GC7处理的Dhps和Dohh KO细胞在高激活受损时细胞恢复率下降，但这一变化不及Eif5a KO那么显著（见图）。2a）。
FACS叠加直方图显示eIF5a或hypusine在d3（GC7和Eif5a）和d4（Dhps和Dohh）处的表达。细胞表面标记Thy1的KO被纳入CRISPR对照。细胞恢复列显示每个处理在采集时与对照处理（CRISPR细胞的GC7和Thy1 KO模拟处理，GC7的n=4个独立实验，Eif5a的7个，Dhps的10个，Dohh的6个）。通过Hoechst 33342染色获得了细胞周期谱。绘制细胞周期阶段的平均百分比，配对单个培养的阳性和阴性细胞（n=4个独立实验GC7,12个独立实验，Eif5a12个，Dhps7个，Dohh8个）。误差条表示实验间的标准差。P值通过配对双侧t检验计算。线条：蓝色、WT或仿制;红色、KO或GC7。条纹：深蓝色，G0-1;浅蓝色，S;白色，G2-M。b 通过流式细胞术将Eif5a-CRISPR细胞根据eIF5a强度分为阳性和阴性群体，并用eIF5a抗体检测（n=5次生物复制）。第1车道：尺寸标记;2-6号通道：已分选的eIF5a+单元（WT）;7-11号通道：已分级的eIF5a-细胞（KO）。c 通过测量溶酶体抑制剂巴非洛霉素A1（BafA1）处理细胞中自噬体膜结合LC3-II的水平与模拟载体处理细胞进行量化（n=3个生物样本，P值使用未配对双侧t检验计算）。中心线和误差条表示生物复制间的平均值±SD）。a–c OT-1 LN T细胞在接受100 nM SIINFELK肽刺激48小时后，先用CRISPR-Cas9 KOEif5a、Dhps或Dohh治疗，或用10 μM GC7处理，随后在IL-2中维持。GC7实验及其对照组独立于CRISPR-KO实验进行。
通过霍赫斯特染色法更详细地研究细胞增殖，以识别细胞周期的不同阶段。令人惊讶的是，GC7抑制eIF5a的催眠导致的细胞周期谱异于Eif5a、Dhps或Dohh敲除后观察到的。GC7在S期导致明显的细胞积累，而Eif5a和Dhps KO细胞倾向于在细胞周期的G0/1期积累，而Dohh的敲除则细胞周期谱没有明显变化（图）。2a） 尽管催眠减少。因此，eIF5a和DHPS的丧失可能导致G1延长或G0-1进入异常，而DOHH KOs中去氧高氨酸化的中间型eIF5a部分活跃，可能减缓细胞周期的进展。相比之下，GC7处理细胞在S期积累，表明该药物对细胞周期具有非靶向影响，超出对eIF5a催眠的影响。
孢子黄苷是eIF5a高管化和功能的关键底物，其丧失影响B细胞和T细胞的自噬通量。与年轻人相比，老年人的T细胞和B细胞自噬减少，这种自噬通过eIF5a支持的主转录因子TFEB翻译机制提供精瓜胺而逆转，TFEB调控自噬29,30。KO CD8 CTL使用溶酶体抑制剂巴非霉素A1（BafA1）或载体处理2小时，并选择性通透以检测自噬体膜结合LC3-II30。自噬通量被定义为BafA1处理细胞中LC3-II的MFI除以载体处理细胞。GC7处理和Eif5a的KO在类似程度上降低了自噬，而Dhps和Dohh的KO则不影响自噬通量（图。2c）。这些数据证实eIF5a对自噬很重要，但似乎与显示Dohh KO细胞自噬减少的数据相矛盾。后者测量了永生化的KO MEFs自噬，因此差异可能反映了残留的eIF5a高管作用，足以维持实验中的自噬通量，也可能与分析中使用的不同细胞谱系有关。
在IL-2 T细胞中进行3-4d培养后，细胞分化为细胞毒性T淋巴细胞（CTL），我们测试了高管化或eIF5a蛋白丧失对效应蛋白功能的影响。KO细胞在最后20分钟内用抗原肽重新刺激4小时，以重新激活效应细胞因子的转录和翻译，并用普罗霉素标记，以评估整体蛋白生成情况。通过流式细胞术分析了将普罗霉素掺入新生蛋白的情况，所有处理后均显示显著减少（见图。3a，b）。相比之下，由Ifng基因编码的特定效应细胞因子IFNγ的产生在Eif5a细胞门上受影响最为显著，大多数细胞处于负门状态，GC7处理和Dhps KO细胞减少较小，而Dohh KO细胞的IFNγ+细胞仅有轻微下降。对照Thy1 KO细胞在总蛋白和特异性细胞因子产生方面均无减少。同时随时间监测细胞因子生成，显示IFNγ蛋白的流失与eIF5a的镜像流失同步（补充图）。相比之下，Eif5a KO细胞在d2时产生的TNF与对照细胞相当，且仅显示d3的少量减少。这些数据表明，IFNγ的产生是选择性的，而非细胞因子翻译的普遍关闭。
FACS点图显示阳性和阴性细胞的门控，直方图显示在染色前用100 nM SIINFEKL肽和Brefeldin A再刺激4小时的GC7或CRISPR KO细胞中，普霉素掺入、IFNγ和TNF表达。线条：灰色阴影，未合并或无再刺激控制;蓝色、WT或Mock;红色、KO或GC7。b 配对样本的平均荧光强度（MFI），分别为阳性和阴性细胞，如（a）显示，来自>4个独立实验（图表中标注的n个个）。P值采用配对双侧t检验计算）。点：蓝色、WT或假点;红色、KO或GC7。c Ifng和Tnf mRNA通过RT-qPCR测量，检测了大量药物处理或转染细胞（n=3个生物样本，P值使用未配对双侧t检验计算）。中心线和误差条代表生物复制体之间的平均值±SD。d 通过FACS通过使用SIINFEKL肽脉冲的EL-4细胞与对照非脉冲、荧光标记的EL-4细胞之间的比例变化来量化T细胞KO及对照群体的特定细胞毒性活性（2个独立实验，各3次技术重复）。误差条表示技术复制之间的标准差。线条和点：黑色，WT;灰色，Thy1;深蓝色，Dohh;浅蓝色，Dhps;红色，Eif5a。
我们通过对GC7/模拟处理细胞及未分离的Thy1、Eif5a、Dhps和Dohh的细胞裂解物进行RT-qPCR分析，评估了KOs对Ifng和Tnf mRNA的转录或翻译是否受到影响。在这些实验中，使用了两种不同的CRISPR导RNA靶向Eif5a，将KO效率提升至>80%，与Dhps和Dohh靶向培养相当。与未再刺激的对照细胞不同，所有用肽重新刺激的细胞均如预期显著上调Ifng和Tnf mRNA（见图）。3c）。Dhps，即Dohh KO或GC7处理的细胞，与对照细胞相比，Ifng和Tnf mRNA未显示出减少，而eIF5a的KO则使Ifng mRNA减少约30%，且Tnf mRNA的产生显著增加。我们得出结论，Ifng的翻译以及较小程度的Tnf是成熟的eIF5a的必要条件，但eIF5a的丧失也会影响转录，例如Ifng，这很可能是因为eIF5a依赖的转录因子翻译减少，这些转录因子对细胞因子产生至关重要，如下所述。
我们测试了Eif5a、Dhps和/或Dohh KO CTL是否杀死了表达抗原的靶细胞（图）。3d）。Eif5a被击倒后，特定杀伤率下降了三倍，而Dohh的丧失无影响，而Dhps的击倒在两项独立实验中杀伤率略有提升。Thy1KO细胞也更有效地杀死靶点，这很可能是因为Thy1是一种高度糖基化的表面分子，可能对效应子：靶细胞的结合产生负面影响。Eif5a KO细胞杀伤能力的下降并非由于关键细胞毒性效应分子Granzyme B的产生发生变化，因为其生成未受eIF5a的丧失影响，也并非由于CTL耗尽，因为PD-1表达保持不变（补充图）。2a）。
我们进一步探讨了KO细胞在体内挑战后是否能对感染做出反应。OT-1 Eif5a、Dhps或Dohh靶向细胞（表达CD45.1）与Thy1 KO细胞（表达CD45.2）均1：1混合，并与表达卵白蛋白的李斯特菌OVA一同注射到野生型受体中。6天后采集脾细胞并评估回收供体细胞的频率（补充图）。2b）。无论eIF5a是否被直接敲除或其高激活受损，感染小鼠中回收的靶向细胞数量极少，均与Thy1-KO对照细胞相比。被回收的CD45.1敲除细胞是未能删除目标基因的细胞（补充图）。2b）表明，对于CD8 CTL细胞的扩增和/或体内存活，eIF5a的表达及其上线至关重要。
通过将4-阿齐多-L-卤素丙氨酸（AHA）取代蛋氨酸掺入新合成蛋白，评估了功能性eIF5a对特定蛋白群的调控，该蛋白对新生肽池进行全球标记。该方法的优点在于它直接测量新蛋白的合成过程，从而比全蛋白质组学更灵敏地表征翻译因子的功能，然而，它在测量mRNA翻译方面可能不如核糖体剖析等传统技术全面。Eif5aKO和GC7处理培养物被用AHA脉冲2小时，固定染色后通过细胞分选分离Eif5a和WT群体，确保未定向WT细胞接受与KO细胞相同的培养和标记条件。分离细胞后，利用铜介导的Click化学法与炔琼脂糖珠分离出AHA标记肽，并利用液相色谱质谱（LC-MS）鉴定并定量了新生蛋白质组。
对12个GC7聚合细胞和模拟处理细胞进行单次无标记蛋白质组学检测，检测到7529个蛋白质，作为所有实验质谱样本的光谱库。利用该文库，鉴定出5953个蛋白被两种以上独特的肽代表（相比之下，未使用文库检测到的蛋白为3682个）。在所有条件下，至少有3246个蛋白质在4个生物样本中表达（补充数据1）。所有这些蛋白质在AHA标记样本中均显著富集（丰富度≥5倍），相比未标记背景。每组使用四个生物复制样本（见图）。4a，左侧）。使用iBAQ值测量蛋白质的绝对量并比较31组。一个样本的空白被其他三个样本的平均值替代。iBAQ值通过NormalyzerDE33上的Vsn算法32进行归一化并进行了log2变换，随后根据输入单元号进行了第二次归一化，以便进行组间比较（见图）。4a，右边;补充图。3a，b;补充数据1）。在四个样本组（Mock、GC7、Eif5a KO和WT）中，GC7处理细胞中新生蛋白整体减少了~3倍。AHA掺入的这一下降与此前使用GC7与模拟处理输入细胞不同比例的蛋白质组学实验一致（补充图。3c），因此不太可能是输入归一化引起的。Eif5a KO细胞与WT细胞之间，以及GC7处理与模拟处理对照细胞间检测到的所有新生蛋白的3D MDS图（图）。4b）显示出区分KO/WT与GC7/Mock最大变异来源（维度1）的4组特征，这很可能是甲醛固定及随后的反向交联所致。第二大变异源（维度2）将KO与WT及GC7与模拟分离，极可能反映了eIF5a活性的操控。分别在GC7和模拟处理细胞之间，以及Eif5a KO细胞和WT细胞之间进行差异表达分析。GC7对蛋白质产生有系统性影响，2617种蛋白被下调，只有5种蛋白质上调（补充图。4a）;而Eif5a KO对蛋白质产生的影响较为有限，有234种蛋白质被下调，216种上调（补充图）。4b）。
示意图，显示分析的基团和识别的蛋白质数量。共检测到5953种蛋白质（左图），其中3246种在所有组别的4个样本中超过3个被检测到（n=4个生物复制）。（右）每组的iBAQ值先用Vsn算法进行归一化，然后按输入单元号进行规范化。每个样本中3246个蛋白质的Log2转化值被归一化后用来表示蛋白质丰度，并绘制为小提琴图。中心线，中央隔离带;箱限、上下四分位;胡须，四分位数范围的1.5倍;分数，例外值。队色：蓝色，模拟;橙色，GC7;绿色，Eif5a WT;红球，Eif5a KO。b 使用3D-MDS图来可视化样本间差异（左图）。右侧绘出每个维度所代表的方差百分比。c 比较了KO细胞与WT细胞之间，或GC7与模拟处理细胞之间，所有检测到的转录因子、核糖体蛋白和翻译因子的归一化蛋白水平的组平均值。显著地（对于KO-WT，配对双侧t检验P值<0.05，绝对FC>1.5;对于GC7-Mock、未配对双侧t检验，带有Benjamini–Hochberg修正FD<R 0.05，绝对FC>为1.5），感兴趣的蛋白质变化以黑色（下调）或红色（上调）字体注释，而统计检验中未被认为显著但仍可能具有生物学意义的蛋白质则用灰色字体注释。在用 ECIPR-Cas9 KO Eif5a 或与 GC7 孵育前，先用肽刺激 OT-1 T 细胞 48 小时。细胞在最后2小时培养期间用AHA标记。Eif5a通过FACS分选，同一培养获得了KO细胞和非靶向（WT）对照。通过Click-chemistry与烔烔琼脂糖珠分离出AHA标记蛋白，并用胰蛋白酶消化。详细的数据处理流程见补充图。3a（n = 4个生物样本）。
利用WebGestalt34对GO项进行聚类，将下调和上调蛋白与所有MS检测到的新合成蛋白进行背景比较（补充图）。4a， b）。GC7和Eif5a KO对转录因子、核糖体蛋白和翻译因子均有明显影响，但方式不同（见图）。4c）。在GC7处理细胞中，环境反应、细胞因子和效应T细胞功能的几个关键调控因子，包括IRF4、ELF1、FLI1、NFκB1、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6和TBET（Tbx21）的产生被下调，而在Eif5a KO细胞中，仅IRF4、ELF1、NFκB1、STAT4，以及较轻程度的FLI1和TBET受到负面影响。尽管两者增殖均受损，GC7处理细胞中细胞周期调节因子E2F3-35的产生下降，但Eif5a击杀细胞则未减少。相比之下，NFκB转录因子RELA对增殖中的T细胞36的存活至关重要，但在Eif5a KO细胞中显著下调，但在GC7处理细胞中则无此现象。一些转录因子被上调，如记忆细胞存活因子FOXO3;而部分在GC7处理细胞中下调，但在Eif5a KO细胞中上调，如CNOT3和CNOT8，这些是CCR4-CNOT死烯酰酶复合体的组成部分，会破坏其目标RNA，包括细胞周期调控因子37,38。
鉴于Eif5a KO对普罗霉素掺入的深远影响，我们研究了新生蛋白质组中细胞翻译机制的组成部分。在71个检测到的核糖体蛋白中，Eif5a KO细胞中有20个上调（补充数据1），而无一个被下调。特定核糖体蛋白的上调表明，在没有eIF5a的情况下，细胞内可能产生成分不同的核糖体，而eIF5a可能优先翻译不同于WT细胞的mRNA子集39,40。此外，翻译起始因子eIF3组分和eIF5的下调表明43 S起始前复合体的形成和功能可能被减弱，而eIF6的增加则阻止60 S核糖体亚基与40 S亚基42结合。这些数据共同展示了Eif5a KO细胞蛋白质生成普遍减少以及翻译谱的改变。上述所有蛋白在GC7处理后均被下调，显示了这些样本中蛋白质合成的更广泛抑制。聚胺已知通过与核糖体43的直接相互作用，调节蛋白质合成的效率和保真度。GC7的eIF5a非依赖效应可能是其对核糖体的竞争性结合取代了细胞内其他多胺。
通过下一代mRNA测序GC7和模拟处理样本，研究了eIF5a对转录因子产生变化后翻译与间接效应的直接影响（补充图）。4c 及补充数据 2）。尽管GC7处理在与eIF5a无关的离靶效应中存在，但这些群体提供了适合的高质量RNA，不同于从甲醛固定、分选的eIF5a KO细胞中提取的RNA。GC7处理样本中翻译下调基因定义为1417个RNA丰度无显著减少但其新生蛋白减少的基因（见图。5a，左维恩图及补充数据3）。这些基因与Eif5a KO中其新生蛋白中还原的基因重叠，而与WT细胞相比（见图）。5a，右维恩图，补充数据3）给出了86个基因，其翻译而非转录，我们可以自信地归为依赖于eIF5a。仅通过GC7处理翻译下调的蛋白质在去氧气指标上富集：核糖体结构成分、mRNA结合、rRNA结合和翻译因子活性（图）。5b）;虽然GC7处理和Eif5a KO均转化还原的86个蛋白未显著聚集成任何 GO 指标，但一些调控细胞功能的关键基因如T细胞受体信号转导FYN、细胞因子受体IL2RG、mTORC1调节因子SLC3A2和SLC7A5、DNA复制因子RFC3/5、转录因子IRF4及翻译因子eIF3F/M均属于该Venn组（补充数据3）。
维恩图叠加显示1417种mRNA未还原的蛋白质（FDR > 0.1或FDR < 0.01和FC > 2，edgeR，n = 4，红点见补充图。 4c 右侧）在GC7处理后，但在其新生肽中下调（FDR<为0.05，FC为<−1.5，未配对双侧t检验配合Benjamini–Hochberg校正，n=4个生物样本）。这些蛋白还与其在Eif5a KO细胞中还原的蛋白（P < 0.05，FC < −1.5，双侧t测试，n=4个生物样本）作为选择被eIF5a翻译调控蛋白的额外标准（86个蛋白）。这些文氏组中的基因列表见补充数据3。b 列出了分子功能中富含 GO 的蛋白质，这些蛋白均为经 GC7 处理或 Eif5a KO 转化影响的蛋白。c eIF5a调控基因集中特定3聚体序列基序的频率，并按这些蛋白质的总长度进行规范化。右侧绘制了50个随机生成的3聚体序列的归一化计数。P值采用单侧费舍尔精确检验计算。d 转录组中随机选择的2900个基因（重复1000次）（灰色）中PPP或PPG基因的箱型图，所有表达蛋白（黑色，n = 8个生物复制）、GC7处理（蓝色，n = 4次生物复制）或Eif5a KO（红色，n = 4次生物复制）中翻译下调基因的百分比。e 列出了数据集中参与调控T细胞细胞毒性功能、分化、细胞周期进展和细胞因子生成的部分eIF5a调控蛋白，并展示了它们在GC7处理和Eif5a KO细胞中新生蛋白的折叠变化。FDR采用无配对双侧t检验并Benjamini–Hochberg校正计算，P值采用配对双侧t检验计算。明暗颜色：黑色，重要或可能重要;灰色，不重要。对于所有箱形图：交叉，均值;中心线，中央隔离带;箱限、上下四分位;胡须，四分位数范围的1.5倍;分数，例外值。
鉴于已发表的证据表明eIF5a促进蛋白质中多脯氨酸和带电氨基酸区的翻译，先前被鉴定为eIF5a控制的3聚体基序（PPP、PPG、DVG、DDG、GGT和RDK10）的频率被统计在eIF5a调控基因组的CDS中（见图）。5c）。与50个随机选择的3聚体序列的频率相比，PPP的富集性较高。PPG和DVG可能被强化，但统计检验>否定了（P 0.99）。为评估这些基因的聚脯氨酸含量，它们与小鼠基因组中编码区44中具有PPP或PPG基序的已发表基因列表叠加。我们绘制了转录组中随机选择的2900个基因中含多脯氨酸基因的比例（重复1000次），所有由LC-MS检测到的表达蛋白，以及GC7处理或Eif5a KO细胞中翻译下调基因的比例（见图。5d）。在GC7处理的细胞中，所有表达和翻译下调蛋白的聚脯氨酸基因比例相似，表明聚脯氨酸无富集，而eIF5a KO细胞中翻译下调蛋白的多脯氨酸含量显著增加（见图）。5d），与KO样本中eIF5a对GC7处理样本的更靶向抑制一致。
随后，我们将分析和验证重点放在一些参与调控T细胞分化、细胞因子产生和细胞周期进程的蛋白质上，这些蛋白质的翻译受到成熟eIF5a的可用性影响（见图）。5e），因为Eif5a细胞KO细胞中观察到这些细胞功能缺陷。此外，这些细胞功能是CD8+ T细胞45中描述的主要年龄相关损伤，表明eIF5a功能受损可能导致免疫衰老。蛋白质通过流式细胞术在模拟处理、GC7处理以及Eif5a、Dhps和Dohh-KO细胞中进行测量（补充图）。2a和5a）。主要结果总结自第3天的Eif5a-KO和第4天的Dhps和Dohh-KO细胞（图）。6）以及治疗后4天的培养（补充图）。5a）。这些基因的mRNA丰度也通过qRT-PCR测量（补充图）。5b）。IRF4、TBET 和 EOMES 是调控 T 细胞中 IFNγ 和 TNF 产生的转录因子46–48，CDK1 与不同的细胞周期蛋白相互作用以促进细胞周期进程49。与系统数据集一致，Eif5a KO、Dhps KO以及Dohh KO细胞中IRF4和TBET的丰度有所下降，但mRNA水平无下降（见图）。6b）这很可能促成了eIF5a KO细胞中Ifng mRNA的减少。相比之下，所有KO细胞在蛋白质和RNA中的EOMES水平均有所下降。CDK1蛋白在Eif5a KO中下降，但在Dhps KO和Dohh KO细胞中并无显著变化，这与图中其RNA水平和细胞周期谱相关。2a. 有趣的是，GC7处理细胞中CD98的细胞表面水平升高，这可能反映了GC7对该蛋白循环的影响，且显然是药物与eIF5a无关的效应，因为该升高在任何CRISPR细胞中均未被观察到。总体而言，我们验证的靶点与系统数据集一致，同时也凸显了GC7处理细胞与CRISPR细胞之间RNA动态的差异。
a 使用eIF5a或高立素细胞内染色鉴定Eif5a、Dhps或Dohh CRISPR-KO细胞中的WT（蓝线）和KO（红线）群体（左侧点图显示KO范围）。Thy1使用CRISPR细胞（灰阴影线）作为KO对照。右侧叠加直方图显示了电子门控WT和KO样本中的IRF4、TBET、EOMES和CDK1表达。b 从（a）中定量多对样本（P值使用配对双侧t检验计算）。点：蓝色，右转;红色，KO。这些基因的cmRNA通过RT-qPCR定量，并根据Actb基因水平进行归一化，在新鲜的大规模转染细胞中进行定量（n=3个生物样本，P值通过未配对双侧t检验计算）。中心线和误差条分别代表生物复制体之间的平均值±标准差（SD）。P值颜色：蓝色，显著;黑色，无显著性。
多胺孢瓜胺在细胞中自然产生，其含量会随着年龄增长而减少。外源性补充精明已被证明能延长生物体寿命20，并以自噬依赖的方式恢复与年龄相关的T细胞功能19。除了对eIF5a的催眠作用外，spermidine还被认为能抑制Ep300的乙酰转移酶活性，从而诱导自噬50。这种非eIF5a依赖的spermidine活性可能导致GC7（一种spermidine衍生物）处理细胞与Eif5a/Dhps KO细胞的表型差异。通过在培养中加入鸟氨酸脱羧酶抑制剂DFMO，以阻断孢瓜萘啶的生物合成，研究了sperminine对活化T细胞eIF5a功能的影响。此外，DMFO处理的细胞会补充外源性精敏定以克服阻滞，或用GC7处理。
eIF5a羟基酶水平的定量反映了这些治疗的预测结果。DFMO处理的细胞的羟基酶减少，补充精莧后恢复到与未处理细胞相当的水平。DFMO对高血质化的削弱因额外GC7处理而加剧（见图）。7a）。然而，当我们通过流式细胞术检查出对eIF5a缺失敏感的蛋白质的总量和选定蛋白丰度时，出现了改变的模式（见图）。7b）。在DFMO处理后，普罗霉素的掺入和CDK1、TBET、IRF4和IFNγ丰度下降，并通过外源性的精瓜胺添加得以恢复，表明它们对细胞中的精明水平非常敏感。DMSO与GC7联合使用进一步降低了普罗霉素的掺入量，以及CDK1和IFNγ的表达，但未进一步降低TBET和IRF4蛋白的丰度。有趣的是，尽管DFMO + GC7和DFMO影响了IFNγ的产生，正如最近在CD8+ T细胞29中报道的那样，该蛋白在所有细胞中仍可检测，而Eif5a和Dhps KO细胞中相当比例的群体未产生可检测的IFNγ（见图）。2b）。相比之下，TNF、CD25和CDC45在DMSO处理后表达无下降，但通过DFMO与GC7联合使用表现有所减少，表明它们对精瓜胺的耗竭反应较不敏感（见图）。7） 尽管显示出eIF5a的某些调控（补充数据1）。
DFMO抑制精瓜胺生合成可减少羟色素染色，这种染色可通过外源性补充精准胺缓解，或通过GC7治疗进一步损害。右侧绘制了5个独立实验中高尿素的MFI（P值采用未配对双侧t检验计算）。中心线和误差条表示独立实验间的平均值±标准差。线条：灰色阴影，-ve 染色控制;蓝色调，未处理;红色，DFMO;绿色，DFMO + Spermidine;橙色，DFMO + GC7。b （a）样本中对细胞因子（IFNγ和TNF）、转录因子（IRF4和TBET）、细胞周期调节因子（CDK1和CDC45）、CD25（IL2受体α）及普罗霉素进行了染色。c 下图显示了来自4项独立实验的脑力错失（MFIs数据汇总，分别针对普罗霉素、TBET、IRF4、IFNγ、TNF和CDC45;5项CDK1和CD25）。对未处理细胞进行了统计检验（P值使用未配对双侧t检验计算）。中心线和误差条表示独立实验间的平均值和 ±SD。P值颜色：蓝色，显著;黑色，无显著性。a， b OT-1细胞在2天内用SIIINFEKL肽刺激，并在IL-2补充培养基中培养2天，之后仅培养IL-2（未处理），或IL-2 + 0.5 mM DFMO、DFMO + 10 μM spermidine或DFMO + 10 μM GC7培养2天。细胞在最后4小时内用SIINFEKL肽+Brefeldin A再刺激，并用普罗霉素标记10分钟后采集，进行细胞内染色和流式细胞术。
综合这些数据表明，某些细胞蛋白如CDK1、TBET和IRF4的维持对功能性高管化eIF5a的可用性非常敏感。而其他蛋白如细胞因子IFNγ则需要对eIF5a或DHPS进行消融，才能显著减少丰度。
我们目前对eIF5a功能的理解主要来自于酵母和转化细胞系的研究，这些细胞连续增殖，因此持续表达活性高激活的eIF5a。相比之下，关于eIF5a在原级哺乳动物细胞中的调控情况报道较少。因此有趣的是，在初代T细胞中，在初代T细胞中，在转化后显著调控了eIF5a活性。幼鼠CD8+ T细胞含有丰富的eIF5a蛋白，但与活化T细胞相比，其处方酶修饰较少。激活后，eIF5a与DHPS和DOHH的转录上调同时发生高激活。通过CRISPR敲除修饰酶或eIF5a本身，在细胞活化后，我们确认了过合对T细胞中eIF5a功能的重要性。eIF5a敲除的表型比DHPS或DOHH敲除更为，表明未修饰的eIF5a存在一定的残留活性，尽管我们不能排除4d后仍有微量残留的羟基蛋白。去氧开液化的中间形态eIF5a在T细胞中明显可检测到，尽管功能有所减弱，因为DOHH的敲除（催化赖氨酸转化为羟基的最后不可逆步骤）的影响远小于去除DHPS，而DHPS是hypusine初始附着的关键。
通过调节多肽延长来控制蛋白质生成，正逐渐成为一种重要的翻译调控手段，超越了更广泛研究的翻译起始调控因子51。拉长失调也被证明会导致神经退行性和癌症等疾病51,52。氨基酰转移RNA的可用性以及关键蛋白如eEF1A、eEF2和eEF2K的作用已被充分记录，用于调控多肽形成速率53。相比之下，eIF5a的贡献尚不甚明，但被认为对mRNA中某些基序的延伸尤为重要，尤其是编码脯氨酸-脯氨酸及其他带电残基的基序10。我们的数据支持eIF5a调控富含PPP基序的蛋白亚组的新译，如前所述16，尽管我们识别的eIF5a调控基因中>50%的编码序列中未包含这些基序。在非脯氨酸带电氨基酸（如DVG、DDG、GGT和RDK10）中，eIF5a耗竭酵母中观察到强烈核糖体停顿。只有DVG在我们的数据集中似乎稍微丰富了一些。此外，分析了含有5' TOP54、IRES55或uORF55基序的mRNA，只有含有5' TOP mRNA的蛋白质在Eif5a KO细胞中合成的比例略高于自助对照组（83个基因，中位数FC = 1.29，P < 0.001，双尾 t检验）。在线基序发现工具如MEME Suite56，无法在eIF5a调控基因CDS中识别富集基序，相较于所有表达蛋白。这些mRNA可能因核糖体组成的变化而受到差异调控，40,57。在eIF5a核糖体相关蛋白的初生多肽丰度发生变化，这可能通过eIF5a对核糖体蛋白翻译的影响而影响mRNA翻译的优先级，而非其延长活性。在一项使用siRNA敲低eEF2表达的研究中，小鼠肝脏中核糖体蛋白上调被报道，eEF2是GTP结合延长因子家族成员58。eEF2与核糖体结合会降低eIF5a-核糖体结合59的亲和力，表明这两种翻译因子在mRNA延长过程中存在互斥或竞争关系。eEF2敲低后上调的蛋白质主要是核糖体蛋白，因为这些蛋白在翻译被抑制的背景下仍被翻译。Eif5a KO T 细胞的初步蛋白质组分析与 eEF2 敲低细胞之间存在一些相似之处，如翻译因子 eEF1b 的上调和 eIF5 的下调，但每个数据集中有更多蛋白质被特异性地上调或下调。
T细胞分化为效应细胞，效应细胞以时间和空间调控的方式分泌细胞因子。免疫细胞中的细胞因子生成既受转录控制，也通过翻译控制，后者涉及miRNA60和RNA结合蛋白4,61。我们发现eIF5a对IFNγ的产生尤为重要，IFNγ是一种重要的效应细胞因子，既用于IFNγ的翻译，也通过IRF4、TBET和EOMES等关键转录因子间接产生。观察到细胞因子产生、T细胞增殖和记忆T细胞形成在衰老过程中的下降27，与淋巴细胞中随年龄相关的精明可用性和eIF5a蛋白丰度下降之间存在有趣的相关性29,30。研究表明，老年小鼠膳食补充精孢胺能促进并改善T细胞记忆形成19及B细胞抗体生成30，支持eIF5a在维持T细胞功能中的积极贡献，此前提出通过维持自噬29。我们的数据显示，尽管所有KO中IFNγ的产生减少，但Dhps和Dohh KO细胞的自噬通量减少，这表明eIF5a对IFNγ调控存在一定程度的自噬非依赖效应，可能通过mRNA翻译速率。
我们的研究考察了eIF5a对CRISPR基因缺失前已预激活的CD8+ T细胞的影响，以识别急性激活T细胞中由eIF5a翻译调控的蛋白，并避免与谱系分化障碍相关的混杂因素。在此情境下，eIF5a功能丧失导致敲除群体在体外和体内数天内死亡。一项近期研究显示，关于多胺代谢与CD4+ T细胞分化的关系，要么是T细胞特异性鸟氨酸脱羧酶的丧失（对孢氨酰胺的产生至关重要），要么是DOHH的丧失，导致新生CD4+ T细胞分化严重偏向，导致IFNγ过量产生62。该效应表现在染色质重塑层面，这在新生的CD4+ T细胞分化中非常重要，暗示eIF5a可能参与分化，但此处未涉及。
GC7因其抗增殖活性63和诱导细胞死亡的能力，被考虑作为多种癌症的治疗方案。在我们的实验中，GC7产生的细胞表型与Dhps敲除非常不同，这在纤维肉瘤细胞系中也显示了65。GC7与沙瓜咪定竞争结合DHPS，并被广泛用作eIF5a功能成熟的抑制剂。由于spermidine具有独立于eIF5a的功能，如抑制Ep300活性，GC7也可能具有类似效果。在我们的LC-MS数据集中，GC7处理导致2617个新生蛋白下调，而eIF5a KO减少了234个蛋白。这些观察表明GC7具有显著的抑制作用，独立于eIF5a。此外，GC7处理后仅下调的蛋白未富含多脯氨酸基序，且显著聚集于与核糖体成分相关的GO项，表明GC7比eIF5a更全局地降低细胞翻译。相比之下，eIF5a敲除导致多种核糖体蛋白丰度增加而非减少。
我们的数据支持eIF5a在调控免疫细胞功能中的重要性。针对eIF5a的催眠已被证明对巨噬细胞具有抗炎作用，66可调控巨噬细胞的线粒体呼吸和活化。我们当前的研究还表明，eIF5a对调控T细胞增殖和部分细胞因子产生具有重要作用，既能直接调控mRNA子集的翻译，也能通过间接影响关键转录因子的产生。这些研究共同支持了eIF5a指向RNA调控的存在，这些调控对调节免疫反应至关重要。
该研究已获得爱丁堡大学生物科学学院伦理审查机构的批准。所有动物实验均由爱丁堡大学生物研究与兽医服务伦理审查机构及英国内政部批准，项目许可P38881828 R.Z.
表达OT-1 TCR转基因（C57BL/6-Tg（TcraTcrb）1100Mjb/J）与Rag-1KO（B6.129S7-Rag1 tm1Mom/J）背景并含有CD45.2或CD45.1同源等位基因的小鼠，作为CD8+ T细胞的LN供体。小鼠年龄在5至12周之间，组织供体性别被随机分配。WT（CD45.1xCD45.2）C57BL/6 J（查尔斯河）小鼠被用作体内实验的受体。所有小鼠均在爱丁堡大学生物研究与兽医服务（BVS）设施中，在特定无病原体条件下逐个通风笼中繁殖。小鼠在12小时光照/12小时黑暗周期内维持，可自由获取食物和水，温度为19–24°C，湿度为45–65%。
淋巴结（LN）OT-I T细胞通过70微米网状过滤器获得，并在IMDM培养基（Sigma-Aldrich I3390）中培养，辅以10% FCS、L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和50微米2β-ME。将100 nM SIINFEKL肽（剑桥肽，定制合成）加入培养基，细胞在37°C下孵育，完成每个实验指定的时间。第2天，活化细胞被洗涤并重新悬浮于培养基中，培养基补充20 ng/mL重组人IL-2（PeproTech AF-200-02），直至培养期结束。对于GC7进行转录组和新生蛋白质组谱分析的处理，细胞在最后两天于10 μM GC7（默克化学259545）的存在下培养。在模拟处理中，培养中加入了等量10毫毫米醋酸载体，替代GC7。在DFMO实验中，活化细胞在IL-2中扩增2天后，再在新鲜IL-2中培养2天，或IL-2补充0.5 mM DFMO（Bio-Techne 2761/50）、DFMO + 10 μM的孢子苜（Sigma-Aldrich S0266）或DFMO + 10 μM GC7。
为再刺激细胞毒性T细胞，在采集前最后4小时加入100 nM SIINFEKL肽和5 μg/mL的Brefeldin A（剑桥生物科学11861-25 mg-CAY）以防止细胞因子分泌。在合成普罗霉素时，在收获前最后10分钟将普罗霉素以10 μg/mL的最终浓度添加到培养基中。
以下导引RNA序列从Integrated DNA Technologies购买：eIF5a（TGCTCAGCATTACGTAAGA和CTTCGAGAGACAG）、Dhps（ATACCTCGTGCAGCACACACA）、Dohh（GCAGTATTCTACGGACCCAG）、Thy1（ACAGACAAGCTGGTCAGTG）和TRAC引导RNA（CAGGGTTCTGGATATCTGT）。Cas9核糖核蛋白复合物通过将2微升100 μM tracrRNA和2微升100 μM crRNA混合在25 μL无核酸酶双链缓冲液中（Integrated DNA Technologies 11-05-01-12），在95°C下培养5分钟，然后与2微升5 mg/mL Truecut Cas9蛋白（Thermo Fisher Scientific A36499）在37°下培养10分钟形成。RNP复合物在转染前立即合成，并与10个6个2天活化的OT-1细胞混合。转染使用Neon转染系统（Thermo Fisher Scientific MPK5000），按照制造商说明完成，设定为1600V，10毫秒，3脉冲。转染后，eIF5a KO在含IL-2培养基中培养3天，Dhps和Dohh KO培养4天。
细胞被转移到含IL-2的无蛋氨酸RPMI培养基中，浓度为5 ×106细胞/mL。细胞被甲硫氨酸缺乏一小时，然后将4-阿齐多-L-卤素丙氨酸盐酸（L-AHA）（Jena Bioscience CLK-AA005-10）加入培养基（最终浓度40微米），并在37°C下培养2小时。 针对eIF5a CRISPR KO细胞的实验，它们在2%甲醛（Sigma-Aldrich F8775）中固定20分钟，并用冰冷的90%甲醇渗透1小时。eIF5a染色在FACS缓冲液（PBS + 0.5% BSA + 0.05% 叠氮**+4 mM EDTA）中，使用抗eIF5a-C末端抗体（Abcam ab32407，使用1：400）一夜，随后用抗兔IgG AlexaFluor 647二级抗体（Thermo Fisher Scientific A27040）清洗和培养，使用时间为1：500）持续1小时。分拣通过FACS咏叹调（BD）进行。
从新鲜冷冻的细胞样本中提取蛋白质（12.5×106 非 AHA 标记，32.5 × 106 GC7,12.5 × 106 Mock，各4个样本）使用Click Chemistry Capture Kit（Jena Bioscience CLK-1065）中的CHAPS溶解缓冲液提取蛋白。输入细胞数调整为注射肽总量相近，确保检测覆盖率相似。对于已分选的固定细胞，使用310微升200 mM Tris、0.5% SDS、200 mM NaCl、pH8.0提取10×106个细胞的蛋白质，并进行短暂超声波扰动细胞沉淀，随后在95°C下逆交联45分钟，然后冰上冷却，最后与等体积的16 M尿素混合，最终达到8 M 尿素浓度。提取的蛋白质与炔烴琼脂糖珠（Jena Bioscience CLK-1032-2）隔夜孵育，随后按照制造商指南使用Click Chemistry Capture Kit进行下游制备，随后在C18进行脱盐（Fisher Scientific 10627275）。GC7和模拟细胞被合并生成高pH反相分馏肽文库。细胞被酶溶于PBS、2% SDS、cOmplete蛋白酶抑制剂（Sigma 11836170001）和20U苯佐纳酶（Millipore 70746），用25 mM TCEP还原，并用25 mM碘乙酰胺烷基化。500微克蛋白与80%丙酮在−20°C下沉淀过夜，分别用100%丙酮洗涤两次，再用90%乙醇洗涤一次。颗粒在100 mM三乙基碳酸氢盐中以37°C夜间消化，随后在C18 Sep-Pak弹匣上脱盐（Waters）。肽在4.6毫米XBridge BEH C18柱（Waters）上分离，置于10 mM铵甲酸盐（pH 9）中，并以1 ml/min速率沿2-50%线性梯度洗脱。收集72个组分，拼接成12组并进行干燥。肽样品被重新懸浮于0.1%TFA中，注射了一半的点击化学捕获肽，并注入约0.5微克的12个文库组分中用于LCMS分析。一台Ultimate 3000 RSLCnano高效液相色谱（Dionex，Thermo Fisher Scientific）通过电喷雾电离与Orbitrap Elite混合离子阱-Orbitrap（Thermo Fisher Scientific）耦合。肽直接装载到75微米×50厘米的PepMap-C18 EASY-Spray液相液析层（Thermo Fisher Scientific），并以0.1%甲酸（溶剂A）和80%乙腈/0.1%甲酸（溶剂B）以250 nl/min速度洗脱。样品在120分钟的线性梯度中被洗脱，从1%到30% B，95分钟内洗脱，再用25分钟洗脱至45% B。MS1扫描以120k分辨率在350–1700 m/z波长下进行，“锁质量"为445.120025 m/z。随后在离子阱中以20个数据依赖的MS2 CID事件，分辨率极快，隔离宽度为2 Da，目标离子积累量为5E3，最大填充时间为50毫秒，碰撞能量为35，前驱强度要求为10k，电荷为2+或以上。5 ppm范围内的前体被动态排除40秒。
Novogene生成了配对端RNA测序数据集读段（GC7和模拟处理样本，4次生物复制），并使用Cutadapt v2.3和fastqc v0.11.8修剪了低质量和适配序列。读取序列通过STAR v2.7.1a68和samtools v1.9比对到小鼠基因组（GRCm38.96）。映射读取序列使用rsubread v1.6.469中的featureCounts函数计数，rtracklayer v1.42.2中添加了基因注释。使用edgeR v3.26.470进行了差分表达分析。
使用MaxQuant版本1.6.2.671分析了新生蛋白质组数据。通过检索来自小鼠基因组GRCm38（访问于2018年2月5日）的UniProt小鼠参考蛋白质组，包含52,599条条目，允许2次三叉酶未切割，允许可变的蛋氨酸氧化、蛋白质N端乙酰化和半胱氨酸氨酰甲化。参数“单个肽质量容忍度"被选为可变前体质量容忍度，分别设定离子阱或轨道阱碎片离子的0.5 Da或20 ppm质量容忍度。目标诱饵阈值为1%，适用于PSM和蛋白质伪发现率。匹配运行在0.7分钟内完成识别转移，20分钟内完成保留时间比对。允许从文库参数组进行匹配，“从"和“到"用于未分馏参数群，并启用了第二次肽搜索。蛋白质的水平由所有归因于其肽的中位强度表示，只有含有超过2种独特检测肽的蛋白质才被认定表达。分析中使用了iBAQ值。所有值均使用Vsn算法32进行归一化，以调整样本加载不等的情况。由于各组使用不同输入单元以实现相似覆盖，Vsn归一化的iBAQ随后被输入单元编号归一化（详见补充图）。3a）。统计检验使用了log2变换的归一化iBAQ值。使用未配对T检验配合Benjamini–Hochberg修正72，确定GC7与模拟处理样本间显著下调的蛋白质。对eIF5a KO与WT样本进行了配对T检验。差异表达分析在Excel 2016中完成。
细胞用活/死水性死细胞染色套件（Thermo Fisher Scientific L34966）标记，然后固定在细胞内染色固定液（BioLegend 420801）中，并用细胞内染色渗透洗涤液（BioLegend 421002）渗透。针对eIF5a（EP527Y，Abcam ab32407，使用1：400）、羟基质（Hpu24，Creative Biolabs PABL-202，使用1：200）、IFNg（XMG1.2，BioLegend 505808，使用1：400）、TNF（MP6-XT22，eBioscience 25-7321-82，使用1：400）、IRF4（3E4，eBioscience 48-9858-82，使用1：200）、TBET（4B10，BioLegend 644832，使用1：200）、EOMES（Dan11mag，Thermo Scientific 53-4875-82，使用1：200）、Granzyme B（GB11， 曾使用BioLegend 515403，使用1：200）、CDK1（A17，Abcam ab18，使用1：200）、CD25（PC61，BioLegend 102016，使用1：200）、CD98（RL388，eBioscience 12-0981-83，使用1：200）、PD-1（RMP1-30，eBioscience 11-9981-82，使用1：200）、CDC45（EPR5759，Abcam ab126762，使用1：200）和普罗霉素（12D10，Millipore MABE343-AF488，使用1：500）;在细胞周期分析中，固定通透细胞用Hoechst 33342（Sigma）和Ki-67抗体（B56，BD Biosciences 556027，比例为1：10）染色。细胞在4°C下与初级抗体孵育16小时，洗涤后用山羊抗兔IgG Alexa Fluor 647（Thermo Fisher Scientific A27040,1：500使用）和大鼠抗小鼠IgG2a PE（RMG2a-62，BioLegend 407108，使用1：200）二级抗体在RT下孵育1小时。采集前细胞被重新悬浮于FACS缓冲液中（细胞分选中描述）。所有分析均针对单重态实时事件进行。
为定量自噬通量，细胞先用或不使用10 nM巴非洛霉素A1（BafA1，Sigma Aldrich B1793）处理2小时，随后使用Flow-Cellect自噬LC3抗体检测试剂盒（Luminex FCCH100171）进行选择性渗透和LC3染色。染色细胞用2%甲醛固定，并在采集前重新悬浮于FACS缓冲液中。样本的自噬通量定义为其在BafA1处理细胞中LC3-II的平均荧光强度除以模拟处理细胞的水平。
细胞毒性测定中，小鼠淋巴瘤系EL-4细胞在37°C下脉冲SIINFEKL肽1小时，并用IMDM洗涤，然后用CellTrace Violet（CTV，Invitrogen C34557）标记;非脉冲的EL-4细胞被标记为CFSE（Invitrogen C34554）。在96个U形板中，9×10个SIINFEKL脉冲EL4细胞与9×10个5个非脉冲细胞结合，T细胞滴定从5×10个6细胞开始，并进行3倍稀释。细胞被培养4小时，并观察CFSE：CTV标记EL4比例的变化。进行了一次重复实验，将CFSE和CTV互换。
所有采集均使用MACSQuant流式细胞仪（Miltenyi Biotec）完成。数据采用Flowjo 9版进行分析。
1 × 105 天 3 Eif5a 或第 4 天 Dhps/Dohh CRISPR OT-1 CD45.2 细胞与 1 × 105 天 4 的 Thy1 CRISPR OT-1 CD45.1 细胞和 1 × 106 表达 OT-1 TCR 靶鸡卵白蛋白（LmOVA）的李斯特菌单核细胞增生细胞，并静脉注射至 WT C57BL/6 小鼠中。注射后第6天，小鼠被宰杀，并采集其脾细胞。细胞在体内用SIINFEKL肽在5 μg/mL Brefeldin A存在下重新刺激4小时，随后染色CD45.1、CD45.2、eIF5a/hypusine和IFNγ。
细胞被溶解在RIPA缓冲液（Thermo Fisher Scientific 89900）中，并辅以蛋白酶抑制剂组合（Sigma-Aldrich P8340）。裂解液被离心去除碎片。还原Laemmli缓冲液被加入裂解物中，样品加热至95°C，并用SDS-PAGE分离。蛋白质转移到Immobilon-FL PVDF膜（Milllipore IPFL00010），并在与原版抗体一起培养前，膜在Odyssey阻断缓冲液（LI-COR Biosciences 927-40000）中孵育。定量信号通过次级Abs生成：IRDye® 680RD山羊反兔和IRDye® 800CW山羊反鼠（LI-COR生物科学926-68071和926-32210，均使用1：5000），并使用奥德赛红外成像系统（LI-COR Biosciences）进行可视化。
主要抗体为：抗ZAP70（克隆29，BD Biosciences 610239，使用比例1：1000）、DHPS（Abcam ab224134，使用比例1：1000）、eIF5a（EP527Y，Abcam ab32407）和hypusine（兔子多克隆Millipore ABS1064，使用比例1：1000;兔单克隆Hpu24 Creative Biolabs PABL-202，使用比例1：1000）。
使用Direct-zol RNA Miniprep套件（Zymo Research R2051）提取总细胞RNA，并用Lunascript套件（New England Biolabs E3010L）逆转录。qPCR在Light Cycler 480（罗氏）上使用Brilliant III SYBR® Master Mixes（安捷伦600883）进行。每个基因的转录水平均与样本中β肌动蛋白（Actb）的含量进行归一化。寡核苷酸（由Integrated DNA Technologies定制合成）列于补充表1。
统计分析使用了Prism 9软件（GraphPad）和Excel 2016。除非另有说明，所有数据点均代表生物复制的测量。除特别说明外，未配对或配对双尾学生t检验用于比较两个方差相等的正态分布数据集。单尾费舍尔精确检验用于检测氨基酸三聚体富集。在GC7-模拟新生蛋白质组数据集中，使用Benjamini–Hochberg方法调整一组多重t检验的P值，且该检验仅有一个原假设。P值用于量化虚无假设检验的统计显著性。*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01。
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