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优化蛋白质 - 链霉亲和素相互作用

更新时间：2026-08-03点击次数：12

                                            优化蛋白质 - 链霉亲和素相互作用：不同生物传感器类型下生物素标记比例的影响



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本技术研究探讨了在 Octet® 生物层干涉（BLI）系统中，不同类型生物传感器采用不同生物素标记比例所产生的影响。链霉亲和素生物传感器（包括 Octet® SA、SAX、SAX2 及 SSA 型）适用于捕获生物素化配体，各类传感器分别针对特定应用场景开发。研究表明，1:1 摩尔偶联比例（MCR）是动力学检测中最大限度减少交联反应的理想条件；而提高摩尔偶联比例能够提升配体固定量，拓宽定制定量检测的动态范围。实验证实，更高的摩尔偶联比例可增大结合响应信号，提升蛋白 A 的检测性能；SAX 生物传感器在信号强度与动态范围方面表现优于 SAX2 传感器。上述结果表明，在生物制品研发工作中，需针对性调整生物素标记方案并合理选用生物传感器，从而优化分析检测效果。

在生物制剂研发过程中，精准检测并定量分析表达的药物分子及其与靶点的相互作用，对于先导候选分子的筛选至关重要。Octet® 生物层干涉（BLI）系统提供无标记分析方案，能够快速、简便地对这类分子进行准确定量，并评估结合特异性与亲和力。链霉亲和素历来作为关键的生物传感器表面介质，用于动力学实验与定量检测。开展此类实验时，配体需经过生物素标记，作为捕获分子。本文探讨配体标记的最佳摩尔偶联比率（MCR）在动力学实验与定量检测场景下的差异，并对比不同型号 Octet® 链霉亲和素生物传感器的配体固定载量。


链霉亲和素生物传感器类型

赛多利斯已开发多种链霉亲和素生物传感器，用于捕获生物素化配体。这类生物传感器（Octet® SA、SAX、SAX2 及 SSA）表面均包被链霉亲和素分子，适用于生物素化配体，但适用场景各不相同。表 1 汇总了各类市售链霉亲和素包被生物传感器的核心特性。更多详细信息，请参阅生物传感器选型指南 ¹。
表 1：可固定生物素化分子的全系列链霉亲和素包被 Octet® 生物传感器 ¹

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研发、制造产品并针对其预期应用开展质量检测；若将生物传感器用于预期用途之外的场景，使用者需自行完成有效性验证。


配体生物素化


链霉亲和素与生物素组成的体系被广泛应用于生物分子稳定且不可逆的非共价结合。可利用生物素标记试剂在体外对蛋白质进行生物素化修饰，这类试剂能够靶向多种官能团，例如伯氨基与巯基。
生物素化操作简便，反应条件温和，不会损伤蛋白质，且可在中性 pH 环境下完成。生物素化反应结束后，必须去除未发生反应的游离过量生物素。由于生物素分子量较小，可借助离心柱（如赛多利斯 Vivaspin® 500）简单去除（该流程在技术说明《优化配体生物素化：分子相互作用分析反应条件》中有更详细阐述）²。应当在生物素标签中引入长连接臂（带有不同长度聚乙二醇链的活性生物素），以降低空间位阻效应，固定肽类等小分子时尤其需要如此。生物素化配体可批量制备并保存，用于多次实验。
在生物素化反应中，摩尔偶联比（MCR）指标记所用生物素的物质的量与待标记蛋白质物质的量之比。配体上样至 Octet® 生物传感器前，标记所需的最佳比例会受配体类型、实验用途等因素影响。


应用

若使用链霉亲和素生物传感器测定分子间动力学相互作用，推荐采用 1:1 摩尔电荷比（MCR），该配比可使每个配体分子平均结合一个生物素。这种低限度生物素化有助于降低生物传感器表面发生交联的风险 ³。

低限度生物素化会因未结合生物素的配体流失而造成更多损耗，但该操作对于获取精准的动力学数据不可少。

用于动力学检测的配体生物素化相关内容，在《配体生物素化优化：分子相互作用分析实验条件》中有更为详尽的阐述。

定量检测应用

采用链霉亲和素生物传感器开展定量检测应用时，需针对特定分析物进行方案定制。与动力学检测实验不同，定制定量实验可将摩尔偶联比（MCR）提升至 1:1 以上，以此获得更好的检测效果。该方式能够提高样品中生物素化配体的占比，使更多配体固定于生物传感器表面，进而提升分析物检测的信号强度与动态检测范围。
为确定定制定量检测实验的最佳生物素化摩尔偶联比，研究设计实验探究蛋白 A 与生物素化兔抗免疫球蛋白 G 抗体的结合作用。实验采用多种摩尔偶联比完成抗体生物素化处理，并将抗体配制成单一浓度，加载至 SAX 与 SAX2 生物传感器。SAX 生物传感器与 SA 生物传感器性能相近，但针对高精度检测场景具备更高精度标准（变异系数指标为 4%）。因此，本实验中 SAX 生物传感器所得实验数据同样适用于 SA 生物传感器。SSA 生物传感器不适用于蛋白质、抗体等大分子物质检测，故未纳入本次实验评估范围。
实验设置 1:1 至 15:1 区间内多种摩尔偶联比，完成抗免疫球蛋白 G 抗体的生物素化修饰。

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如图 1 所示，当摩尔交联比（MCR）从 1:1 升高至 15:1 时，两种传感器上抗体固定的结合响应均有所上升。在各个摩尔交联比条件下，SAX 传感器的抗体固定量均高于 SAX2 传感器；对于摩尔交联比 15:1 与 10:1 体系，SAX 传感器的固定响应直至更晚的时间点（400–500 秒）才逐渐趋于平稳。而 SAX2 传感器在摩尔交联比 10:1 和 15:1 条件下会更早达到平台期（约 200 秒），随着时间推移，5:1 摩尔交联比体系也达到相同平台水平。
完成抗体固定后，将传感器浸入不同浓度的蛋白 A 溶液中进行实验（图 2）。在任一蛋白 A 浓度与任一摩尔交联比条件下，蛋白 A 与固定在 SAX 生物传感器上生物素化抗体的结合水平，均高于固定在 SAX2 传感器上的抗体。该结果与图 1 中 SAX 传感器可固定更多抗体的现象相一致。两种传感器均呈现相同规律：更高摩尔交联比（5:1、10:1、15:1）对应的结合响应峰值更大，在蛋白 A 高浓度条件下该现象尤为明显。这一规律同样与传感器表面抗体固定量的高低直接相关。

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图 1：生物素标记抗体在 SAX 与 SAX2 传感器上的固定。将抗体按照一系列摩尔偶联比（MCR，1:1 至 15:1）进行生物素化处理，随后以单一浓度加载至 SAX 和 SAX2 生物传感器上，固定时长 600 秒（n=7）。


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图 2. 蛋白 A 与固定抗体的结合。不同浓度蛋白 A（2.7–2000 纳克 / 毫升）与图 1 中固定抗体传感器的结合过程（结合时长 120 秒，单次实验 n=1）。图中展示各多重循环反应条件下，SAX（蓝绿色曲线）与 SAX2（黑色曲线）的响应曲线。


为研究摩尔浓度比（MCR）与生物传感器类型对定量检测动态范围的影响，在 Octet® 分析软件中采用 R 平衡结合速率方程对曲线进行拟合（代表性曲线见图 3A、3B）。采用无权重五参数逻辑方程（5PL）计算得到浓度响应曲线（图 3C、3D）。两种传感器类型下，摩尔浓度比为 1:1 和 2:1 时，蛋白 A 处于高浓度区间（222–2000 纳克 / 毫升）的标准曲线出现平台期；计算所得结合速率差异极小，难以区分该区间内各浓度样本。

图 3 结合速率与剂量响应曲


相比之下，在较高摩尔偶联比（5:1、10:1 和 15:1）条件下，检测方法的线性范围有所拓宽，标准曲线高浓度区间的区分度更佳。无论摩尔偶联比高低，低浓度蛋白 A（2.7–74 纳克 / 毫升）对应的结合速率均可以明显区分。上述数据表明，提高捕获配体偶联所用的摩尔偶联比，有望拓宽蛋白 A 定量检测的动态范围。相较于 SAX2 生物传感器，采用 SAX 生物传感器同样能够拓宽该检测方法的动态范围：蛋白 A 高浓度组之间的信号区分度提升，整体响应信号幅值更高。为探究其影响

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适用于蛋白 A 结合的拟合。将 R 平衡拟合结合速率方程应用于图 2 中蛋白 A 结合动力学曲线。图中展示 (A) SAX 以及 (B) 摩尔浓度比 1:1 生物素化抗体对应的 SAX2 代表性动力学曲线。(C、D) 基于 R 平衡拟合数据得到的 SAX 与 SAX2 在全部摩尔浓度比区间（1:1 至 15:1）下的剂量响应曲线。采用不加权 5 参数逻辑标准曲线方程进行拟合。0 20 40 60 80 100 120 时间（秒） 0 0.1 0.2 0.3 纳米


结论：业界普遍认为，动力学生物层干涉（BLI）检测实验的生物素标记最佳摩尔浓度比（MCR）为 1:1。针对定量检测实验，本技术说明中的数据证实：若将生物素标记摩尔浓度比提升至该比例以上（例如 5:1 或 10:1），在配体浓度固定时，生物传感器表面能够结合更多配体。这说明标记反应中被生物素化的配体占比更高，减少了未生物素化配体的损耗，节约珍贵实验试剂。配体负载量提升可增强分析物结合能力，拓宽定制定量检测实验的动态范围。本研究数据可佐证该结论：抗体负载量更高时，高浓度蛋白 A 的信号区分效果与检测效果更佳。相关数据同时表明，开展定制定量检测时，相较于 SAX2 生物传感器，优先选用 SAX 生物传感器更为合适。尤其是需要检测高丰度或低丰度分析物的场景，SAX 传感器具备更广的动态范围与更强的信号强度。此外，采用更高摩尔浓度比搭配 SAX 生物传感器，能够拓展实验线性范围，从而输出更精准的数据，提升粗样品等体系中分析物检测结果的可靠性。