Duolink®‑PLA 邻位连接技术：原位蛋白互作与翻译后修饰研究利器

摘要：邻位连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA，商品化试剂盒为 Duolink‑PLA），将抗体特异性识别与核酸滚环扩增（RCA）相结合，可在固定细胞、组织切片中原位检测内源性蛋白‑蛋白相互作用、蛋白翻译后修饰、蛋白同源 / 异源二聚化，无需过表达、无需基因编辑；当两个靶标空间距离小于 40 nm 时即可产生可计数荧光斑点，实现互作事件可视化、亚细胞定位与半定量分析，弥补 Co‑IP、FRET 等传统技术短板，广泛应用于肿瘤、免疫、病毒、信号通路、临床病理样本研究PMC。

关键词：Duolink‑PLA；邻位连接；蛋白‑蛋白相互作用；滚环扩增；原位检测；翻译后修饰

1 引言

蛋白‑蛋白相互作用是细胞信号传导、增殖凋亡、免疫应答、病毒感染等生命过程的分子基础。传统互作研究各存在固有局限：Co‑IP 需要裂解细胞，丢失空间定位信息，偏向捕获稳定强相互作用；FRET 需要荧光标签过表达，易造成蛋白异位、空间位阻，难以检测内源蛋白；普通免疫荧光共定位仅代表空间重叠，不能证明真实物理互作PMC。

Duolink‑PLA 邻位连接技术巧妙把蛋白识别信号转化核酸信号，在保留细胞 / 组织完整形态前提下，直接观测内源性蛋白之间微弱、瞬时的互作事件，同时可检测蛋白磷酸化、泛素化等翻译后修饰，FFPE 临床石蜡样本同样适用，现已成为分子细胞生物学主流原位检测手段PMC。

2 Duolink‑PLA 核心工作原理

PLA 反应分为邻位识别、DNA 成环连接、滚环 RCA 扩增、荧光杂交成像四大步骤，只有两个靶标分子空间距离≤40 nm 才会产生信号，距离超过阈值不会触发扩增，从机制上降低假阳性。

1. 邻位识别阶段选用不同物种来源的两种一抗分别识别两个靶蛋白（如兔抗蛋白 A，鼠抗蛋白 B）；后续加入一对 PLA 探针（PLUS 探针、MINUS 探针），这是偶联单链寡核苷酸的二抗，分别结合两种一抗 Fc 区。若两个靶蛋白发生物理结合，两个 PLA 探针被拉近至 40 nm 以内，满足邻位条件；无互作分子探针距离较远，无法启动后续反应。

拓展：检测蛋白翻译后修饰（如某蛋白磷酸化），可采用 “总蛋白一抗 + 修饰位点特异性一抗" 配对。

2. 连接成环阶段加入连接缓冲液、接头寡核苷酸与 T4 连接酶；接头序列同时和 PLUS、MINUS 探针上寡核苷酸互补，仅探针足够靠近时，接头完成杂交，连接酶催化形成闭合环状 DNA 分子，作为滚环扩增模板；未靠近的探针不能形成闭环，无扩增模板，不产生信号，这是 PLA 特异性关键环节。

3. 滚环扩增 RCA 信号放大加入 Phi29 DNA 聚合酶，以环状 DNA 为模板发生滚环扩增，合成一条长达数千拷贝重复单元的长单链 DNA；单个互作事件信号放大可达约 1000 倍，实现单分子灵敏度，低丰度、瞬时互作也可以被检出。

4. 荧光探针杂交与成像定量荧光标记的寡核苷酸探针与 RCA 扩增产物重复序列杂交；荧光显微镜 / 共聚焦显微镜下，每一个离散荧光斑点代表一次蛋白邻位 / 互作事件；统计单个细胞内斑点数量实现半定量，同时直接读取互作发生亚细胞位置（细胞核、胞质、细胞膜）。

3 样本适用范围

Duolink‑PLA 兼容绝大多数病理与细胞样本，样本要求为固定后样本，不能用于活细胞：

• 细胞样本：贴壁细胞爬片、离心涂片、悬浮固定细胞

• 组织样本：冷冻切片、FFPE 福尔马林石蜡包埋切片（切片厚度 5‑10 μm 最佳）

• 衍生方案：flow‑PLA 结合流式细胞术，实现大样本细胞群高通量统计；多色 Multicolor‑PLA 同一张切片最多同时检测 4 组独立互作事件；明场 PLA 可适配病理光学显微镜，适合临床病理归档样本分析Sigma-Aldr...。

4 标准实验简要流程

整体实验周期约 1 d；石蜡切片需增加抗原修复步骤。

1. 样本固定、通透；FFPE 样本脱蜡、热诱导抗原修复

2. PLA 封闭液封闭，降低非特异性结合

3. 两种一抗 4 ℃孵育过夜（必须不同宿主来源）

4. PLA‑PLUS、MINUS 探针孵育

5. 洗涤后，连接酶体系孵育（不可随意更改时间温度）

6. Phi29 聚合酶滚环扩增孵育

7. 荧光检测探针杂交，DAPI 复染细胞核

8. 洗涤、抗淬灭封片；共聚焦显微镜采集图像

9. 图像分析：统计细胞内 PLA 荧光点数量，分组统计差异

关键可暂停节点：一抗孵育结束、封片避光‑20℃可长期保存玻片；连接、扩增步骤温度时间严格不可改动Sigma-Aldr...。

5 技术优劣势对比

优势

1. 检测内源蛋白，无需质粒转染、无需标签过表达，适合临床 FFPE 病理标本

2. 原位保留空间信息：不仅判断有没有互作，还能看到互作发生在细胞膜 / 胞质 / 细胞核

3. 灵敏度高：RCA 信号放大，捕捉微弱、瞬时、低丰度互作

4. 可检测翻译后修饰、蛋白同源二聚、异源二聚；支持多指标并行检测

5. 仪器门槛低：常规荧光共聚焦显微镜即可完成，可半定量统计斑点数

局限性

1. 信号代表空间距离＜40 nm，属于邻位事件，需要合理对照排除假阳性，不等同直接证明蛋白复合体功能

2. 高度依赖一抗质量，两个一抗必须特异性好，必须来自不同物种；一抗非特异结合直接带来大量背景斑点

3. 仅用于固定样本，不能活细胞实时动态观测；无法像 Co‑IP 拿到复合物做下游质谱

4. 属于半定量手段，斑点计数受成像参数、样本预处理影响，实验必须设置全套对照

6 必须设置的三套关键实验对照（非常重要）

PLA 斑点容易出现非特异背景，缺少对照的文章结果会被审稿人质疑，每组实验务必设置 3 组阴性对照PMC：

1. 只省略第一种一抗，保留第二种一抗 + 全套 PLA 试剂

2. 只省略第二种一抗，保留第一种一抗 + 全套 PLA 试剂

3. 两种一抗全部省略，仅加 PLA 探针、酶与检测体系

理想状态：对照组几乎看不到荧光斑点，处理组出现明显数量增加的 PLA 信号。条件允许增加已知无互作蛋白配对作为生物学阴性对照。

7 主要科研应用场景

1. 信号通路研究：受体二聚化（EGFR‑HER2）、胞内接头蛋白互作、激酶‑底物原位结合；观察药物刺激前后互作强弱变化

2. 翻译后修饰原位检测：蛋白磷酸化、泛素化、SUMO 化，观察修饰发生位置与水平

3. 肿瘤病理研究：临床 FFPE 样本中检测肿瘤驱动分子复合体， biomarker 辅助评估

4. 病毒‑宿主互作：病毒蛋白与宿主内源蛋白在感染细胞内原位结合定位

5. 细胞器接触位点：线粒体‑内质网接触位点 MAM 复合体原位可视化

6. 药物筛选：96 孔板高内涵‑PLA，评价小分子化合物对蛋白互作的抑制 / 激活效果

8 与传统互作技术对比简表

表格

 9  实验常见问题与优化思路  

1. 全片大量非特异荧光斑点（高背景）原因：一抗非特异、封闭不足、探针浓度过高；优化：降低一抗浓度，充分洗涤，使用试剂盒配套封闭与抗体稀释液；重新验证一抗特异性。

2. 无 PLA 信号排查：一抗物种来源是否区分；样本抗原修复不足；连接 / 扩增孵育温度出错；靶蛋白表达量过低；固定过度破坏抗原表位。

3. FFPE 石蜡切片信号弱优化：优化热诱导抗原修复（柠檬酸盐 / EDTA 缓冲液梯度测试），适度延长一抗 4 ℃过夜孵育。

10 小结

Duolink‑PLA 邻位连接技术填补传统互作实验技术缺口，把蛋白互作从试管带回完整细胞与组织切片，特别适合内源蛋白、临床病理样本，能够直观展示蛋白互作发生位置与相对强弱。但 PLA 检测是 “邻位事件"，实验必须设置完整阴性对照，结合 Co‑IP、功能回补等多重实验，共同证明蛋白相互作用生物学意义。