腺苷脱氨酶：结构-活性关系及利用生物催化获取嘌呤核苷类似物
亮点
对腺苷脱氨酶（ADA）介导核碱基脱氨基（C到U和A到I）机制的深入理解，有望为核苷类前驱药物设计提供更好帮助，这对于应对病毒感染的新威胁至关重要。
从自然界中获得的经验教训将使工程ADA的构建成为可能，从而加速制造多样化核苷构建块，这些构建块对于合成反义寡核苷酸作为治疗药物至关重要。
ADA作为DNA和RNA碱基转化的精确工具日益重要，促使开发可固定再利用的方案——建立可持续的方法。
ADA在实现脱卤化、甲氧基化和非立体异构分解方面的能力，促使人们进一步探索作为复杂分子晚期功能化试剂。
RNA编辑这一新兴领域在治疗应用中激发了人们对ADAs作用RNA的结构及其作用的浓厚兴趣。目前，正在进行使用短引导RNA的临床试验，以部署内源性ADARs。我们推测这些研究可能成为有需要患者的治疗途径。
摘要
鉴于核酸治疗和技术（如基因编辑、反义、siRNA）日益普及，开发高效且可持续的核苷类类似构建模块的途径变得紧迫。腺苷脱氨酶（ADA）是一种普遍存在的酶，在嘌呤代谢过程中催化腺苷不可逆的水解脱氨转化为肌氨酸。它已被用于生物技术用途，使合成获得修饰核苷类似物，并应用于基因编辑和治疗干预。本综述概述了嘌呤底物的结构修饰及其对ADA活性的影响。我们还提供了未来方向的视角，强调了在酶工程和生物技术应用中ADA活跃度需要增加的数据。
利用合成化学中的自然工具箱
核苷是核酸的基本构件，由核糖/脱氧核糖核心连接到嘌呤或嘧啶碱基组成。核苷类似物是核苷的结构修饰变体，在糖和/或核碱基成分上进行了改造，在治疗成就上具有里程碑意义，已有50多种类似物获准临床用于抗病毒或抗癌药物[1–5].此外，修饰核苷在新兴寡核苷酸治疗中作为基础构件发挥着重要作用，尤其是通过核糖环的2′位修饰。
生物催化是合成化学中的核心工具，能够在温和条件下提供具有高选择性的酶[6,7].近年来，生物催化剂越来越多地被应用于更复杂的合成难题，核苷类类似物必然成为重要的靶点[8–11].这包括使用激酶、磷酸化酶、转糖化酶，以及最近在合成这些关键构建单元和药物时，采用整套生物催化级联反应12–14].在这一背景下，另一类酶也变得重要，即脱氨酶，其中腺苷和胞苷脱氨酶分别负责将腺苷转化为肌氨酸（A到I）和胞苷转化为尿苷（C到U）。两者都介导杂基修饰，使芳基胺转变为醇（实际上是菘转酰胺的转变）。芳基胺转化为醇的化学过程在合成上具有挑战性，尤其是在应用于多功能核苷类类似结构时更是如此，目前还需依赖于新合成化学途径的发展。因此，脱氨酶可被视为利用生物催化提升合成核苷类似物修饰能力的基础。
腺苷脱氨酶（ADA）在哺乳动物细胞中较为普遍[15人类ADA有两种同工酶，HsADA1和HsADA2 [16,17其中HsADA1占主导地位，存在单体和二聚体形式，但这两种形式在细胞内活性中都扮演重要角色[18].它们是锌依赖的金属酶，通过将腺苷转化为肌苷来控制腺苷水平。
A-to-I转换是RNA在转录后常见的修饰，肌苷是尿酸代谢中的重要中间体;它是其他核苷（如鸟苷）的前体，并通过结合胞苷、尿嘧啶或腺嘌呤来改变RNA碱基配对。此外，近期研究描述了肌苷及相关类似物具有有前景的治疗潜力[19表现出神经保护[20]，抗肿瘤[21]，以及抗炎特性[22].虽然有多篇关于ADA的综述文章涵盖其生物化学、疾病中的作用及相关疗法[23–28]，据我们所知，尚无关于该酶在获取多种核苷类似物中效用的综述。本文旨在弥补这一空白，首先简要介绍ADA的结构和功能，随后广泛探讨该酶在获取核苷类似物时的结构-活性关系。我们通过先考虑核糖中修饰的类似物，然后研究杂环碱基的变化来结构调查。最后，我们展示了利用ADA作为大规模靶点合成和基因编辑催化剂的工业和生物技术应用的最新实例。
ADA的结构与功能
通过对现有晶体结构的分析，已对ADA催化作用机制的分子层面洞察（见图1）) [23].HsADA1由一条α/β链蛋白组成，由352个氨基酸组成。它采用平行的α/β桶形结构，中央有八股β股和八条周边α螺旋，称为TIM桶。酶与底物之间的氢键网络在催化过程中稳定了过渡态[29].
图1 （A） 人类腺苷脱氨酶（HsADA1）的晶体结构。插图：活性位点放大视图，突出多个组氨酸残基，协调必需锌离子。经PDB授权转载：7RTG [30].（B）拟议在ADA活性位点内进行腺苷水解脱氨。展示了关键氨基酸建立重要的酶-底物氢键网络。
在腺嘌呤环的C6位发生水解加-消除，最终释放氨（见图1）) [18].一个关键的锌原子位于基底结合裂隙深处，并以四面体排列排列，与HsADA1的His214、His17、His15和Asp295相互作用[29].与Asp295共享锌配体配位位点的水分子最终与C6氨基交换[18]，而一系列氢键跨活性位点稳定腺苷底物和四面体中间体，在催化过程中稳定腺苷底物和四面体中间体，最终形成肌苷产物[15].为了与底物的N1形成氢键，Glu217的羧酸基团大致与嘌呤环共面。Gly184的NH与底物的N3之间形成氢键。除了与Zn协调之外2+Asp295与底物C5-OH和His238形成分子间氢键。框架中核糖部分与该基序的结合对于催化至关重要（见下文）。
探索ADA与核苷类似物的混杂性
尽管上述腺苷与ADA活性位点残基之间存在许多关键相互作用，HsADA1及其他变异体已被证明能耐受多种不同的底物。
核糖骨架的结构改造
修改C2′和C3′位置
腺苷核糖上的C2′和C3′位置修饰被ADA良好耐受。例如，C2′，C3′-O-异丙基腺苷（1）和C2′，C3′-二乙酰地腺苷（3）转化为相应的肌苷衍生物2和4，分别以91%和90%的产率实现（见图2）) [31].双环六氢异苯呋喃（HIBF）核苷5也用ADA脱氨生成核苷6，虽然速度比底物1和3慢，但72小时后以50%产率产生相应的肌苷衍生物[32].HIBF肌苷6在人类外周血单核细胞（EC）中表现出抗HIV-1活性。50= 12.3 μM），表明通过该修饰在较低pH下提供稳定性并提升生物利用度。
图2（A）兼容的C2′、C3′修饰腺苷衍生物1、3和5，利用腺苷脱氨酶（ADA）成功脱氨。（B） C2′和C3′-脱氧腺苷7和9脱氨生成相应的inosine类似物8和10。蓝点代表糖中脱氧的部位。
研究表明，尽管HsADA1对活性位点的结合亲和力较弱，但其催化C2′-脱氧腺苷脱氨（7）产率达95%（见图2) [33].相关地，虫草素（C3′-脱氧腺苷，9）也通过ADA脱氨生成C3′-脱氧单胺10，这一点在高达10克的定量产率上得到了验证（见图2）。然而，这种转换需要高温和更长的反应时间[34].这两个例子表明，去除C2′或C3′羟基的同时保持ADA活性是可行的。虫质素9表现出多种药理活性，但在ADA作用下这些作用会减少。为了提高核苷9的生物利用度并克服这一限制，该化合物通常与已知的ADA抑制剂戊二醇联合使用[35].
修改C4′位置
碳环核苷类似物，即将醚类氧替换为碳，包括阿里斯特霉素11和新扁霉素A13，也被ADA脱氨。这些天然抗代谢物作为代谢清除途径的一部分，产生碳环肌苷12和新扁霉素D14（图3）) [36].最近，ADA被提出作为利用新扁霉素A的可药物靶点[37]，即癌症中ADA的上调使化疗中常用的腺苷类似物失活[38,39].Schinazi等人开发了一种非天然的核苷前药（−）-β-d-2,6-二氨基嘌呤二氧烷（DAPD）（15），通过ADA有效脱氨生成（−）-β-d-二氧肐鸟嘌呤（DXG）（16）。有趣的是，DAPD可溶于水且具生物利用度，使其成为临床研究中作为抗HIV药物在耐药患者中试验的有吸引力的药物候选[40].
图3：天然存在的碳环腺苷——阿里斯特霉素11和新平霉素-A13及其在血液中通过腺苷脱氨酶（ADA）脱氨转化为肌苷衍生物的过程。
表1ADA对类似物7和17–22脱氨的动力学数据[41]
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通过高性能液相色谱（HPLC）数据中，在dA类似物（500微米）与ADA反应45分钟后，峰值面积计算得出。
在C4′处用α烷基或α腈取代增加K。M (表1，化合物18和19），显示对ADA的亲和力降低。C4′-烷基（18）和C4′-氰基（19）取代的差异为边缘（K）M= 145.9 μM 对 156.9 μM，但与天然的C2′-脱氧腺苷7（K）相比，差异显著M= 42.6微米）。这些C4′-α修饰据称能稳定糖环的C2′-外显/C3′-内峰（北侧）构象，而非典型底物偏好的C2′-内侧/C3′-外围（南侧）构象。利用HsADA1的晶体结构坐标进行进一步结构分析，确定了衍生物17中C4′-乙烯基团与Met155侧链活性位点的空间相互作用。此外，该类似物中的C2氟化通过电子效应减少了脱氨;pKa腺嘌呤碱基中的N1发生改变，在第一机械步骤中减少质子化。随后对脱氨的耐药性提升了伊斯拉特韦（17）及相关化合物（20–22）的抗病毒活性，减少了所需剂量。
修改C5′位置
C5′-氢氧基基结构对ADA的催化活性至关重要。C5′-OH保护的（如O-乙酰）或C5′脱氧类似物表现出丧失酶活性[42].C5′-OH与His17和Asp19的氢键结合，按催化过程中稳定过渡态（见图1）。在存在C5′胺（一种替代的氢键基团）时，活性仍保持有限，表明在该位置设计羟基仿形态有潜力。此外，将腺嘌呤环的位置从C1′切换到C5′会产生抗抗ADA的类似物[43].因此，磷酸化核苷类似物无法被ADA脱氨，但常被用作前药以提高溶解度和通透性。例如，氟达拉滨5′-O-单磷酸是一种化疗药物，不会被ADA去氨，从而实现快速去磷酸化和细胞吸收[44].另外，AMP脱氨生成IMP需要腺苷单磷酸脱氨酶（AMPDA），这是利什曼原病中嘌呤回收途径的重要组成部分 [45].
嘌呤核碱基的结构修饰
C2位置的替代
含有杂碱基C2氨基的类似物具有重要意义，因为它们为ADA介导的鸟苷（及其衍生物）的合成或递送创造了机会[46].合成含有鸟嘌呤核碱基的核苷类类似物因溶解度低而挑战性。典型底物包括奈拉滨（23），这是一种用于治疗T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）和T细胞淋巴细胞淋巴瘤（T-LBL）的化疗药物。该核苷类似物含有C6-甲氧基，该基团在血液中通过ADA快速脱甲氧基化，将阿拉伯糖（Ara）-G（24）作为活性药物（见图4）。此外，维达拉滨（25）是一种用于治疗疱疹病毒的抗病物，在体内通过ADA快速脱氨生成Ara-H（26）。然而，25的低溶度对其临床应用构成限制，因此正在寻求开发具有抗ADA性的维达拉滨衍生物[46].ADA还将2,6-二氨嘌呤核苷转化为鸟苷的速度仅是腺苷的四倍。此外，2,6-二氨基-2′-脱氧嘌呤核苷（27）是代谢脱氨的底物[47].一系列核糖修饰的2,6-二氨基嘌呤衍生物（27–30）通过ADA成功脱氨，生成了相应的鸟苷衍生物31–34，产率为>80%（见图4）) [48].然而，一些底物反应时间较长（可达15天），需要对最终的鸟苷进行大量纯化。有趣的是，从嘌呤的C2-胺转为C2-卤素后，通过ADA对C6脱氨的抗性，使得化疗药物克洛法拉滨（C2-氯-2′-氟阿拉伯腺苷）、克拉达滨（C2-Cl，2′-脱氧腺苷）和氟达拉滨（C2-F，2′-氟阿拉伯腺苷）进入。同样，伊斯拉特韦（17）中的C2-F嘌呤修饰也排除了ADA转化（如表1所示）。C2卤素原子可能影响催化所需的四面体过渡态中间体的稳定化;由于该地点周围电负性增强和空间阻碍，质子转移和水活化可能受到干扰。
图4（A）人腺苷脱氨酶（HsADA）对腺苷核苷类似物治疗药物23和25的脱氨。（b）鸟苷（31–34）的合成，通过C6脱氨基化C2/C6-bis-氨基前体实现。（C）在N7位修饰的腺苷类似物，生成抗抗ADA脱氨的化合物。蓝点代表脱氧部位，橙色点代表脱氧位置。（D）在C8位修饰的腺苷类似物可被ADA脱氨生成相应的肌苷衍生物。
N7职位的调整
结核苷酸（N7-地氮苷，35，见图4）是一种从结核链霉菌中获得的抗生素。用碳替代N7使结核苷酸抗氨化，从而延长治疗潜力并降低剂量要求。这一能力已通过其他N7-deaza衍生物得到优雅的体现，包括C3′-脱氧-结核苷36和N7-脱甲-C2′-甲基结核苷37（见图4）) [49,50].
C8位置的替代
C8-氟腺苷（38）被小牛ADA去除胺的速度慢于腺苷（K）猫= 64秒−1对342 S−1分别，并且表现出增加的K。M (KM= 74 μM 对38和K的表现M= 腺苷38微米） [51].C8-氯腺苷（39，图4）已被证明能消耗肺、乳腺和肾细胞系中的ATP并抑制肿瘤生长[52].然而，该化合物的一个限制似乎是ADA的脱氨作用，ADA抑制细胞生长，这一点在人类胶质瘤细胞系的研究中得到了证明。53].用氮替代C8碳，生成C8-阿扎腺苷（40) [54]，提供一种类似物，其脱氨速度比腺苷快，利用小牛肠道ADA生成C8-azainosine。这种肌苷衍生物抑制ADA作用于RNA（ADAR1），而ADAR1在RNA编辑中起着关键作用。因此，C8-阿扎腺苷整体上降低了腺苷到肌苷的编辑活性，尤其是在甲状腺癌细胞系中[55]，抑制细胞生长、入侵和迁移。
总之，基于这些例子，衍生腺苷类似物中的核糖和杂基基团对ADA活性具有重要作用，常常在酶的最佳识别中发挥决定性作用[56,57].尽管如此，糖环和杂碱基周围的位点特异性修饰已被成功证明，这种结构与活性的关系在图5和表2中有总结。
图5 腺苷类似物中核糖和腺嘌呤核碱基当前结构修饰及其对腺苷脱氨酶（ADA）活性的影响概述（红十字或绿勾）。
表2
核苷类似物修饰及其对ADA活性影响的总结
ADA的工业规模利用
ADA已被应用于工业层面获取肌苷/鸟苷类似物。Ionis制药公司披露了ADA介导的2′-O-（2-甲氧基乙基）-2,6-二氨嘌呤41脱氨基化，以产生对应的鸟苷类似物42（见图6）。反应持续20小时，目标产物从溶液中沉淀并通过过滤收集。材料42的产率为81%，纯度>98% [58].该过程中使用了Codexis的商业ADA（ADA-101）。
图6（A）腺苷脱氨酶（ADA）介导的2′修饰鸟苷合成42。ADA-101 是商业来源于 Codexis。（B）利用ADA合成卡波韦44完成嘌呤脱氨。
Carbovir 44是一种碳环鸟苷类似物，核糖环内含有C2′、C3′烯烃，目前被广泛用作潜在的HIV治疗方法。早期在60克级的合成中使用ADA脱氨前体43，以93%的分离产率获得鸟苷衍生物44（见图6）) [59].本研究作者未说明使用的是哪种ADA，仅表示其来源为商业来源。Xia等人开发了一种高效的五步合成方法，用于从廉价的C2′-脱氧腺苷（dA）合成2′-脱氧鸟苷（dG），总产率为49%。值得注意的是，ADA在将2,6-二氨嘌呤碱基转化为20克标度鸟嘌呤的最后步骤中成功应用[60].
这些例子表明，将ADA从学术实验室环境部署到工业规模工艺中，且反应的简单性成为此类应用的吸引力。此处所示底物保留了对酶活性重要的C5′-羟基，但包含更广泛的结构变化（C2′修饰和碳环烯烃），进一步表现出酶多样性，并更广泛地作为驱动脱氨反应的工具。
ADA在RNA编辑中的作用
RNA编辑已成为纠正致病突变和开发新型治疗工具的多功能方法。61].ADAR催化双链RNA中的脱氨。由此产生的肌苷被核糖体和RNA聚合酶识别为鸟嘌呤，从而改变遗传密码。这可以改变蛋白质功能，调控基因表达，并促进抗病毒防御[62].目前，正在追求一种靶向方法，将ADARs导向不同转录本中的特定腺苷，以开发治疗导引链以纠正RNA中的致病突变。化学修饰寡核苷酸被用于促进目标细胞的摄取，并提高ADAR反应的代谢稳定性和效率。
在此背景下，Beal及其同事开发了一组核苷类类似物，这些类物在提高或抑制ADAR1和ADAR2（这两种活性人类ADARs）体外脱氨速率方面都有效[63].选定的C2′修饰类似物[C2′-脱氧腺苷和C2′-脱氧C2′-氟阿拉伯腺苷（FANA）]提高了导引链-1位点的编辑速率，目标为C5′-UA位点。相比之下，锁核酸（LNA-A）、C2′-脱氧-C2′-氟腺苷和β-C2′-脱氧腺苷的编辑效果较腺苷减少。值得注意的是，LNA-A消除了编辑，表明锁定构象具有抑制作用，进一步巩固了核糖内C4空间充血影响ADA活性的观点。结果表明，采用DNA典型C2′-内膜内膜糖皱（而非RNA中的C3'-内膜）的类似物，表现出更高的编辑速率。有趣的是，ADAR2的活性位点无法通过额外的C2-胺取代基容纳嘌呤。尽管这些类似物被HsADA有效去氨，但ADAR2在−1位的编辑抑制作用被观察到。
结语及未来方向
ADA在生物技术中的应用具有重要作用，在基因编辑和工业规模靶点合成中均有展示（见前文）。这使合成能够通过简单途径获得潜在的新构建块和生物聚合物，包括鸟苷衍生物，而这些在传统制备过程中往往具有合成挑战。
本综述中汇总的结构到活动特征和数据可用于未来更高效的ADA表格工程。据我们所知，只有少数酶工程研究发现了活性提升的ADA变异，其中细菌的ADA通过噬菌体显示进化出用于RNA编辑[64另一种是编码双His标签以显示大肠杆菌表达和纯化的改进 [65].此外，通过固态或计算机分析阐明不同ADA的进一步结构信息，将是推动更广泛工程化的重要步骤。Burke等人最近展示了胞苷脱氨酶的工程技术，使其对molnupiravir（一种治疗冠状病毒病）的抗病物合成具有非自然反应性[66].这使得胞苷中的芳基氨基直接转化为羟基功能，而非尿苷，表明ADA有潜力以相关方式获得新的嘌呤类似物。鉴于本文所述ADA底物耐受的灵活性，这应使其成为获取新型核苷类比空间的重要工具，无论是作为衍生核酸合成的构建模块，还是用于生物/治疗评估。虽然提到的胞苷脱氨酶是被设计成接受羟胺而非水，但其他小亲核试剂也可被探索。最近，Gao等人报道了对一种天然存在的tRNA编辑脱氨酶的研究，该酶多杂交且能够进行DNA的dA到dI和dC到dU脱氨，开启了化学转化领域的新探索领域[67].
为了开发高效的工程方法，还必须开发更先进的分析技术，以实现对ADA介导转换的高通量分析。目前，需要一种可靠的筛选方法来探索新型核苷类似物与ADA的兼容性。由于氨作为副产物产生，其检测方法可被探索以促进ADA活性和分析。获得这些数据将使酶活性能够定量，并能快速获得针对ADA活性的新型结构。
展望未来，ADA在生物技术中的应用为合成人群体带来了许多机遇。核酸治疗在临床环境中的使用频率正在增加，因此对模拟构建模块的需求也在增加。对这些分子的生物催化方法将为广泛的核苷构建块提供稳健且环境兼容的访问。如图所示，ADA是一种活跃度良好的杂交酶，但进一步的工程努力将带来更大的底物范围和工艺可达的生物催化剂。对该生物催化剂的工程对于实现工业利用至关重要。鸟苷衍生物尤其难以获取，在水系中的溶解度是常见问题。因此，提高热稳定性和有机溶剂的耐受性将成为未来工程项目中更接近更适合合成基底条件的重要目标。
进一步发现野生型ADA也将有助于扩大该酶的应用范围。包括宏基因组分析在内的技术可以帮助揭示大量假想的酶[68]，且目前已知的抗核反应剂相对较少，这种方法有助于加速合成的采用。如前所述，市场上核酸疗法数量的增加只会增加对高效合成核苷修饰方法的需求，而ADA正准备成为实现这一目标的核心工具箱。
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更新时间：2026-09-10
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