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更新时间：2026-09-29
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Strep-Tactin®XT 4Flow® 在 FPLC 系统中的应用与参数设置
Strep-Tactin®XT 4Flow®（IBA 货号：2-5010-025）是基于 4% 高度交联琼脂糖基质偶联 Strep-Tactin®XT 配基的亲和层析填料，专门用于 FPLC/ÄKTA 系统自动化纯化Strep-tag®II / Twin-Strep-tag®重组蛋白。低浓度 4Flow 琼脂糖基质孔道开放，可容纳超大分子量蛋白扩散进入微球内部；XT 配基具备 pM 级亲和力（针对 Twin-Strep-tag），适合低丰度、多聚体、大分子复合物一步纯化，洗脱条件温和，蛋白活性保留率高，同时支持在位碱清洗，可反复循环使用。本文介绍填料特性、FPLC 全套方法参数、缓冲液配方、操作流程、故障排查与再生维护方案，适用于 ÄKTA pure、ÄKTA go 等主流 FPLC 工作站。
关键词：Strep-TactinXT 4Flow；FPLC；ÄKTA；Twin-Strep-tag；亲和层析；蛋白纯化
基质：4% 交联琼脂糖，粒径 50–150 μm 球形微球，排阻极限高达 3×10⁷ Da，大分子蛋白可高效进入孔道，解决传统高浓度琼脂糖填料大分子穿透差、回收率低的痛点IBA-Lifesc...
配基：Strep-Tactin®XT（链霉亲和素突变体），对 Twin-Strep-tag pM 亲和力；Strep-tag®II nM 亲和力
动态载量：11 mg/mL 填料（Twin-Strep-tag 融合蛋白）
最大耐受压力：3.5 bar，FPLC 运行背压低，无需限流装置
pH 稳定区间：4.0–10.0；可耐受 100 mM NaOH 在位清洗，循环使用≥50 次
洗脱机制：脱硫生物素（Desthiobiotin）竞争结合，非变性温和洗脱，不破坏蛋白高级结构与蛋白复合物
全部缓冲液推荐 0.22 μm 滤膜过滤、超声脱气，防止气泡干扰 FPLC 压力与紫外基线
结合缓冲液 Buffer W：100 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1 mM EDTA，pH 8.0
洗脱缓冲液 Buffer BXT：Buffer W 体系添加 2.5 mM 脱硫生物素（Desthiobiotin）
再生缓冲液 XT-R：3 M MgCl₂；备选在位清洗：100 mM NaOH
储存缓冲液：含 0.02% 叠氮钠的 Buffer W
样品前处理：裂解上清 18000×g，4 ℃离心去除沉淀，0.45 μm 过滤；样品黏度大时用 Buffer W 稀释，避免 FPLC 压力飙升
CV = Column Volume，柱床体积；检测器：A280 nm，监测紫外吸收曲线；收集器按峰收集或固定体积收集
1 mL 预装柱：流速 0.5–1.0 mL/min；5 CV Buffer W
5 mL 预装柱：流速 1.0–3.0 mL/min；5 CV Buffer W
判定标准：A280 基线平稳，压力稳定无波动
1 mL 柱：0.5–1.0 mL/min
5 mL 柱：1.0–2.0 mL/min（大分子蛋白建议降低流速提升结合效率）
压力监控：全程压力不得超过 3.5 bar；压力快速升高，立即降低流速或稀释样品
收集穿透液（Flow-through），保留用于 SDS-PAGE 评估目标蛋白漏出情况
流速与上样保持一致；5–10 CV Buffer W
淋洗终点：A280 紫外信号回落至基线附近；充分去除杂蛋白、核酸与非特异性吸附组分
流速：0.5–1.0 mL/min（降低流速提升洗脱分辨率）
洗脱程序：连续通入 Buffer BXT，直到 A280 回到基线
收集策略：0.5 CV / 管分步收集；Twin-Strep-tag 蛋白洗脱峰集中，通常前 2–3 管富集目标蛋白；洗脱后样品可透析去除脱硫生物素
两种方案任选其一方案 A（MgCl₂再生，推荐常规使用）：3–5 CV XT-R（3 M MgCl₂），去除强非特异性吸附；随后 5 CV Buffer W 重新平衡方案 B（碱清洗，污染严重时）：3 CV 纯水 → 3 CV 100 mM NaOH（停留 15–30 min） → 3 CV 纯水冲洗 → Buffer W 平衡
⚠️ 碱洗不可长时间浸泡填料，完成碱洗必须充分冲洗中和
再生平衡完成后，通入含 0.02% 叠氮钠 Buffer W；2–8 ℃冷藏保存，严禁冷冻。
压力控制：填料最大压力上限 3.5 bar，超过该压力会造成琼脂糖微球压缩，柱床塌陷，降低柱效；样品中细胞碎片、蛋白聚集体是压力升高最常见诱因，样品过滤不可省略
标签适配：XT 版本高亲和力，优先适合 Twin-Strep-tag低丰度蛋白；单纯 Strep-tag II 蛋白纯化可评估普通 Strep-Tactin 填料，更容易洗脱
大分子蛋白优势：4Flow 低浓度琼脂糖，超大蛋白、多亚基复合物、病毒样颗粒 VLP 相比传统 Superflow 填料回收率显著提升，是该填料在 FPLC 应用中的核心亮点
温度：蛋白复合物 / 不稳定蛋白整套纯化流程建议 4 ℃冷柜环境运行 FPLC 系统
表格
| 现象 | 原因 | 解决办法 |
|---|---|---|
| A280 洗脱峰低，目标蛋白大量在穿透液 | ①上样过载；②流速过快大分子来不及结合；③样品含游离生物素 | 降低上样量；降低上样流速；样品避免含生物素添加剂 |
| 背压持续升高 | 样品未充分过滤，聚集体堵塞柱筛板 | 停止上样，执行 CIP 碱清洗；样品严格 0.45 μm 过滤 |
| 洗脱峰拖尾 | 非特异性吸附较强；配基结合过强 | 延长淋洗 CV；使用 XT-R 再生；可在 Buffer W 中添加低浓度 Tween-20 |
| 重复使用后载量下降 | 再生不充分；叠氮钠缺失导致微生物污染 | 增加再生 CV；每次纯化后规范再生，2–8℃保存 |
Strep-Tactin®XT 4Flow® 搭配 FPLC/ÄKTA 系统，可实现原核、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞来源 Strep 标签重组蛋白自动化亲和纯化；尤其适合低表达量蛋白、超大分子量蛋白、蛋白复合物、膜蛋白复合体的一步高纯度制备，单步纯化纯度可达 95% 以上。整套方法可保存为 FPLC 预设程序，实验重复性好，方便多批次样品连续自动化纯化。
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