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发布时间：2013/3/14
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1．为了洗脱细菌，将BL21或BLT5615过夜培养的菌液用M9LB稀释到在600nm处OD值为1。如果使用BLT5615菌株与T7Selectl—1或T7Selectl0—3载体，就必须向菌液中加入IPTG，使其终浓度为10umol/L。
2．将900/21该菌液加到裂解后的细胞中，于室温下孵育10分钟。
3．为了测定T7噬菌体的产出量，从步骤2的试管中分别取1ul 1：10稀释液、1ul原液和10ul原液铺板，每种铺3个：分别取1ul 1：10稀释液、1ul原液和10ul原液加入14ml 聚苯乙烯管中， 同时还加入300rrl的BL21或BLT5615（含IPTG） 菌液，并与4ml熔化的（45～50℃）上层琼脂混合。将含有噬菌体和细菌的上层琼脂倒于LB琼脂（BL21）平板上，或是倒在含50gg/ml羧苄青霉素的LB琼脂（BLT5615）平板上。将平板置于37℃孵育1，5～3小时，或室温下孵育过夜。
4．为了测定每份器官或组织的噬菌体总的产出量，将每个平板上的噬菌斑（pfu）数目除以铺板体积（0．1ul、1ul或10ul），然后再乘以1000ul。这样计算的原因是每份细胞沉淀中添加了1000gl菌液。例如：在脑组织的1ul培养基平板中平均有200pfu的噬菌体，那么在脑组织中噬菌体总产出量为2．0×105pfu/g。对每份器官和组织中的3个平板的计数取平均值，对数据作图。
5．为了扩增及纯化回收的T7噬菌体，将步骤2所剩的噬菌体加到10ml在600nm处OD值为0．5的BL21或BLT5615（加有10mmol/L的IPTG） 菌液中。于37℃摇瓶培养2小时，直到菌液被裂解并变澄清。
6．将菌液倒入30ml的Oak Ridge离心管中，并在Sorvall SS—34或同等的转子中， 以8000r/min（7670g）离心10分钟。通过带0，2um滤头的注射器将每份上清分别过滤到50m1无菌锥形瓶中，并保存于4℃。T7培养物上清典型的滴定量为107pfu/ul。我们采用T7溶菌液直接进行下面的实验，而没有用沉淀法进行进一步的纯化。
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