MO-L018 His标签标记套件 RED-tris-NTA 第二代
His-tag labeling kit RED-tris-NTA 2nd generation Monolith His-Tag标记套件RED-tris-NTA第二代为使用我们的荧光染料对少量His标记蛋白进行特定位点、无纯化的便捷标记方式。该套装可用于任何携带多Histidine标签（His-tag）的蛋白质或肽的标记，并含有足够标记500次单点MST测量的材料。标签贴花可在30分钟内完成，无需去除多余染料。RED-tris-NTA第二代染料能高效结合含有至少六个Histidine且Kd在个位数nM范围内的His标签。遵循该优化方案，优化至近100%染色剂与His标记蛋白结合，省去了额外的纯化步骤，确保最佳效果。RED-tris-NTA第二代染料在约650 nm和670 nm处表现出荧光激发和发射最大值。
His-tag labeling kit RED-tris-NTA 2nd generation 产品编号：MO-L018
Monolith 二代 RED-tris-NTAHistidine标签标记试剂盒用于使用二代 RED-tris-NTA 染料对Histidine标签蛋白进行标记适用于微量热泳动（MST）实验，可完成 500 次单点 MST 检测
组分与储存条件
所需额外材料
本 Monolith Histidine标签标记试剂盒常温运输。每套试剂盒所含试剂可完成 500 次单点 MST 检测。2 支 125 pmol 二代 RED-tris-NTA 染料【-20℃保存】1 支 2 mL 5×PBS-T 缓冲液（稀释后得到 10 mL 含 0.05% 吐温 20 的 1×PBS）【-20℃保存】1 支 1200 pmol 六Histidine对照肽【-20℃保存】有效期：见试剂盒外包装
可调速台式微量离心机
1.5 mL 微量离心收集管
0.2 mL PCR 管
超纯水
蛋白标记操作步骤
Monolith 二代 RED-tris-NTA Histidine标签标记试剂盒可便捷地对少量Histidine标签蛋白实现位点特异性标记，无需纯化。本试剂盒可标记任何带有多聚Histidine标签（His 标签）的蛋白或多肽，试剂量可支持 500 次单点 MST 检测。标记反应 30 分钟即可完成，无需去除多余染料。二代 RED-tris-NTA 染料可高效结合至少含有六个Histidine的 His 标签，解离常数（Kd）可达个位数纳摩尔级别。按照本方案操作，染料与Histidine标签蛋白结合率接近 100%，省去额外纯化步骤，保证实验结果。二代 RED-tris-NTA 染料的荧光激发峰约为 650 nm，发射峰约为 670 nm。
实验开始前重要说明
本方案为 Monolith NT.115 仪器的标记操作流程；若使用 Monolith NT.115Pico 仪器，请查阅第 7 页常见问题 8 获取补充信息。
Histidine标签是常用蛋白标签，广泛用于亲和纯化。His 标签标记方法特异性高，仅需纳摩尔浓度的Histidine标签蛋白，且无需去除染料。即使是未纯化样品、细胞裂解液或其他复杂生物液体体系，都可完成标记。此外，His 标签标记体系对多种常用储存缓冲液与实验缓冲液组分耐受性良好。部分可能干扰标记反应的缓冲组分，其浓度上限见表 1。标记反应推荐使用磷酸盐缓冲液（PBS），也可选用 HEPES 缓冲液，pH 控制在 7~8。Tris 缓冲体系以及 pH 低于 7 的环境会显著降低染料与 His 标签的亲和力，不建议使用。为保证高标记效率，建议预先测定染料与目标Histidine标签蛋白之间的亲和力（步骤 A）。试剂盒配套六Histidine肽作为阳性对照互作体系，可评估表 1 未列出的缓冲组分或配体是否会产生干扰（更多详情见常见问题 3）。
表 1：常见缓冲液组分及其最大允许浓度
2步骤 A染料对目标蛋白的亲和力
第二代 RED-tris-NTA 染料与目标Histidine标签蛋白之间的亲和力及标记效率如何？
若要测定该Histidine标记染料对目标Histidine标签蛋白的亲和力，或是测定蛋白在最终实验相互作用缓冲液中的标记效率，推荐采用下述实验方案。如果选用其他缓冲体系，可用科研人员选定的相互作用缓冲液替换 PBS-T：
向装有 5 倍浓缩 PBS-T 的瓶中加入 8.0 mL 超纯水，配制成 1 倍 PBS-T。
用 25 微升 PBS-T 溶解染料，配制得到 5 微摩尔 / 升染料溶液。
取 2 微升 5 微摩尔 / 升染料与 198 微升 PBS-T 混匀，配制 200 微升、浓度为 50 纳摩尔 / 升的第二代 RED-tris-NTA 染料 PBS-T 溶液。
在 PBS-T 中配制 30 微升、浓度为 4 微摩尔 / 升的Histidine标签蛋白溶液。
向 2 至 16 号孔 / PCR 管中各加入 10 微升 PBS-T。
向第 1 号孔 / PCR 管中加入 20 微升 4 微摩尔 / 升Histidine标签蛋白溶液。
使用移液枪从 1 号孔 / PCR 管吸取 10 微升配体至 2 号孔 / PCR 管，反复吹打混匀；再吸取 10 微升混合液转移至 3 号孔并混匀。对 4 至 16 号孔重复该梯度稀释操作。舍弃 16 号孔多出的 10 微升液体。
向每个孔（1–16 号）中加入 10 微升 50 纳摩尔第二代 RED-tris-NTA 染料溶液，通过移液吹打混匀。
室温孵育 30 分钟。
装入毛细管，在 40% 发光二极管 / 激发光功率以及中等微量热泳动功率（NT.Control 组为 40% 微量热泳动功率）条件下检测样品。
可在 MO.Control 或 MO.Affinity Analysis 软件中通过解离常数拟合计算解离常数 Kd。
若第二代 RED-tris-NTA 染料与目标Histidine标签蛋白的亲和力高于 10 纳摩尔（Kd ≤ 10 nM），请继续执行 B 部分蛋白标记第一节。
若第二代 RED-tris-NTA 染料与目标Histidine标签蛋白的亲和力低于 10 纳摩尔（Kd > 10 nM），请继续执行 B 部分蛋白标记第二节。
若第二代 RED-tris-NTA 染料与目标蛋白之间的亲和力过低（Kd > 50 nM），建议调整实验缓冲液以提升亲和力，或更换针对赖氨酸（货号：MO-L011）或L-Cysteine（货号：MO-L014）残基的共价标记方案
B 步骤蛋白标记I）His 标记染料与目标蛋白的亲和力大于或等于 10 nM（解离常数 Kd ≤ 10 nM）。下述方案适用于单次实验，共 16 根毛细管；若选用其他缓冲体系，可用实验人员选定的相互作用缓冲液替换 PBS-T 缓冲液。若已完成方案 A 步骤，可直接从第 3 步开始。可根据需要按比例放大或缩小反应体积。
向含 5×PBS-T 的瓶中加入 8.0 mL 超纯水，配制成 1×PBS-T。
用 25 μL PBS-T 重悬染料，配制 5 μM 染料溶液。
取 2 μL 5 μM 染料溶液与 98 μL PBS-T 混合，配制 100 nM 染料工作液。
将蛋白浓度调整至 200 nM，体系体积 100 μL。
取 90 μL 浓度为 200 nM 的蛋白溶液与 90 μL 浓度为 100 nM 的染料溶液混合。
室温孵育 30 分钟。
样品于 4 ℃、15000 g 条件下离心 10 分钟，将上清转移至新离心管。
蛋白标记完成，可用于结合实验。
II）第二代 RED-tris-NTA 染料与目标蛋白的亲和力小于 10 nM（解离常数 Kd > 10 nM）。下述方案适用于单次实验，共 16 根毛细管；若选用其他缓冲体系，可用实验人员选定的相互作用缓冲液替换 PBS-T 缓冲液。若已完成方案 A 步骤，可直接从第 3 步开始。可根据需要按比例放大或缩小反应体积。
向含 5×PBS-T 的瓶中加入 8.0 mL 超纯水，配制成 1×PBS-T。
用 25 μL PBS-T 重悬染料，配制 5 μM 染料溶液。
取 2 μL 5 μM 染料溶液与 98 μL PBS-T 混合，配制 100 nM 染料工作液。
将蛋白浓度调整为 A 步骤测得 Kd 值的 20 倍，体系体积 100 μL（示例：若染料与蛋白的 Kd 为 40 nM，则配制 100 μL 浓度 800 nM 的蛋白溶液；实验体系中蛋白终浓度为该数值的 1/4，即 200 nM）。
取 90 μL 蛋白溶液与 90 μL 浓度为 100 nM 的染料溶液混合。
室温孵育 30 分钟。
样品于 4 ℃、15000 g 条件下离心 10 分钟，将上清转移至新离心管。
蛋白标记完成，可用于结合实验。
注意事项：针对高亲和力相互作用，过高的蛋白浓度会影响 Kd 测定（若实验体系蛋白浓度高于相互作用 Kd 值，仅能测定半效应浓度 EC50）。若第二代 RED-tris-NTA 染料与目标蛋白亲和力过低（Kd > 50 nM），建议调整实验缓冲液以提升亲和力，或改用针对赖氨酸（货号：MO-L011）、L-Cysteine（货号：MO-L014）的共价标记方案。
C 步骤结合实验推荐在 PCR 管或低吸附表面 384 孔微孔板中配制系列稀释液；若选用其他缓冲体系，可用实验人员选定的相互作用缓冲液替换 PBS-T 缓冲液。
在 PBS-T 或选定实验缓冲液中配制 25 μL 配体溶液，浓度为目标终浓度的 2 倍（示例：目标终浓度 500 nM，则配体配制浓度为 1000 nM）。确保整套梯度稀释体系不存在缓冲液差异。
在 2～16 号孔 / PCR 管中各加入 10 μL PBS-T。
将 20 μL 配体溶液加入 1 号孔 / PCR 管。
用移液枪从 1 号孔 / PCR 管吸取 10 μL 配体溶液转移至 2 号孔 / PCR 管，反复吹打混匀；再吸取 10 μL 转移至 3 号孔 / PCR 管并混匀。重复该操作至 4～16 号孔 / PCR 管，弃去 16 号孔 / PCR 管多余的 10 μL 液体。
向 1～16 号每个孔中加入 10 μL 标记好的蛋白，吹打混匀。实验体系中目标蛋白终浓度为 50 nM（或更高，参考 B 步骤 II），该浓度将用于 Kd 值计算。
装入毛细管，检测样品。推荐参数：LED / 激发光功率 40%，中等 MST 功率（NT.Control 模式下 MST 功率 40%）。染料终浓度 25 nM、LED / 激发光功率 40% 条件下，Monolith NT.115 仪器检测荧光强度约为 300 计数。
常见问题
即使调高 MST 功率，信噪比仍然太差，无法进行数据分析。如何改善信噪比？溶液中游离染料会降低信噪比。若标记前蛋白浓度估算偏高，体系会存在过量染料。建议重新测定蛋白浓度，或提高蛋白与染料比例，例如调整至 5:1。
标记后的蛋白是否可以继续稀释？可以，标记完成的蛋白可进一步稀释。使用 Monolith NT.115 开展 MST 检测时，第二代 RED-tris-NTA 染料推荐浓度为 10 nM。LED / 激发光功率 100% 时，荧光强度通常可达约 250 计数，光漂白速率极低。第二代 RED-tris-NTA 染料具备独特化学性质，抗光漂白能力强。高亲和力检测相关说明，请参见问题 8。
随着配体浓度升高，观察到配体引起的荧光变化。是否是配体干扰 His 标记或染料？如需判断配体是否干扰 His 标记过程，建议使用配套对照肽开展对照实验：
取冻干对照肽，用 120 μL PBS-T 重悬，配制成 10 μM 对照肽溶液。
取 2 μL 10 μM 对照肽溶液与 98 μL PBS-T 混合。
取 2 μL 5 μM 染料溶液与 98 μL PBS-T 混合，配制 100 nM 染料工作液。
取 90 μL 浓度 200 nM 的肽溶液与 90 μL 浓度 100 nM 染料溶液混合。
室温孵育 30 分钟。
配制 25 μL 实验所用最高浓度 2 倍的配体溶液。
在 2～16 号孔 / PCR 管中各加入 10 μL PBS-T。
将 20 μL 配体溶液加入 1 号孔 / PCR 管。
用移液枪从 1 号孔 / PCR 管吸取 10 μL 配体溶液转移至 2 号孔 / PCR 管，反复吹打混匀；再吸取 10 μL 转移至 3 号孔 / PCR 管并混匀。重复该操作至 4～16 号孔 / PCR 管，弃去 16 号孔多余的 10 μL 液体。
向 1～16 号每个孔加入 10 μL 标记后的对照肽，吹打混匀。
装入毛细管检测样品，LED / 激发光功率 40%，中等 MST 功率（NT.Control 模式下 MST 功率 40%）。
如果检测到结合曲线或依赖配体浓度的荧光变化，说明配体大概率会干扰标记过程。建议改用针对赖氨酸（货号：MO-L011）、L-Cysteine.
（货号：MO-L014）的共价标记方案。
目标蛋白需要二价阳离子或辅因子才能正常发挥功能，标记阶段能否将其添加到 PBS-T 缓冲液中？可以，蛋白发挥功能所需的辅因子可直接加入 PBS-T 缓冲液。相关限制条件请查阅表 1。钙离子等二价离子不可加入 PBS 缓冲液，会产生沉淀。也可选用 HEPES 作为标记与实验缓冲液。
我需要研究蛋白 - 蛋白相互作用，两种蛋白均带有 His 标签，该如何操作？第二代 RED-tris-NTA 染料对蛋白的标记属于可逆标记。尽管解离速率很慢，染料仍可从一个带 His 标签的蛋白转移至另一个带 His 标签蛋白。因此建议选用其中一个无 His 标签的蛋白作为结合对象。如果 His 标签旁设计有特异性蛋白酶识别序列（例如 TEV 酶切位点），可在蛋白纯化阶段通过酶切去除蛋白的 His 标签。
目标蛋白储存缓冲液与第二代 RED-tris-NTA 染料不兼容，有什么替代方案？这种情况建议更换缓冲液，可选用任意缓冲液置换柱完成置换。
第二代 RED-tris-NTA 染料溶液和对照肽溶液能否保存？可以，溶液可保存约 8 周。建议分装为 5～10 μL，置于 - 20 ℃冷冻保存。
使用 Monolith NT.115Pico 仪器或检测高亲和力相互作用（Kd 为皮摩尔级或低纳摩尔级）时，能否使用第二代 RED-tris-NTA 标记的蛋白，且蛋白浓度为低纳摩尔或高皮摩尔级别？取决于染料与目标 His 标签蛋白的亲和力。因此建议在开展结合实验前先进行验证（见 A 步骤）；稀释标记蛋白用于结合实验前，需严格按照本手册 B 步骤的标记条件操作。染料与 His 标签蛋白的相互作用亲和力预期可达个位数纳摩尔级别。这种情况下，可采用相近浓度的目标蛋白开展结合实验，并对应调整 LED / 激发光功率。但请注意，染料 - 蛋白相互作用是可逆的，低浓度条件下随时间推移可能发生解离。使用 Monolith NT.115Pico 仪器时，推荐蛋白终浓度 50 nM、染料终浓度 10 nM，LED / 激发光功率设置为 10%，荧光强度约 12000 计数。
第二代 RED-tris-NTA 染料能否标记细胞裂解液中未纯化的 His 标签蛋白？可以。前提是染料在细胞裂解液环境下仍能与 His 标签蛋白保持较强亲和力，需在结合实验前验证（A 步骤）。裂解液中常见的强去污剂（如 SDS）会破坏结合相互作用，应避免使用。推荐采用机械破碎方式（例如杜恩斯匀浆器）搭配 PBS 缓冲液制备细胞匀浆。在细胞裂解液这类复杂体系中，建议设置合适对照以排除非特异性相互作用干扰
上海宝叶生物科技有限公司
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