Af1521 Macrodomain Affinity Resin Set (agarose beads)

背景

郁金香生物实验室有限公司 Af1521 宏结构域亲和树脂套装专为单 ADP 核糖基化（MAR 化）与多 ADP 核糖基化（PAR 化）蛋白的分离及研究设计。借助该亲和树脂，可从细胞或组织裂解液中分离 MAR 化与 PAR 化蛋白。结合在树脂上的蛋白能够从亲和树脂上洗脱，并通过免疫印迹或其他方法开展分析。

Af1521 是源自炽热古球菌的嗜热蛋白，含有一段约 190 个氨基酸的保守结构域，即宏结构域。宏结构域广泛存在于各类生物体内，涵盖细菌、病毒以及脊椎动物。已有研究证实，经表达纯化的 Af1521、Alc1、macroH2A 与 Bal/PARP9 蛋白来源宏结构域，可高特异性、高亲和力结合部分多聚与单体 ADP 核糖修饰蛋白。

产品说明

货号 4301 的 Af1521 宏结构域亲和树脂套装内含以下各 1 份：

Af1521 宏结构域亲和树脂，1 毫升（含 1 毫克融合蛋白，混悬液形式，压实树脂体积约 100 微升），货号 2302

Af1521 宏结构域阴性对照树脂，0.5 毫升（含 0.5 毫克融合蛋白，混悬液形式，压实树脂体积约 75 微升），货号 2303

货号 2302 的 Af1521 宏结构域亲和树脂，为在大肠杆菌中表达、高度纯化的GSH S - 转移酶 - Af1521 宏结构域融合蛋白构建体，并偶联于GSH微球。适用于部分 PAR 化蛋白与多聚 ADP 核糖（PAR）的亲和纯化（下拉实验）。Af1521 宏结构域蛋白可结合部分单 ADP 核糖基化蛋白与 ADP 核糖。

货号 2303 的 Af1521 宏结构域阴性对照树脂，除两处甘氨suan突变为天冬氨酸的位点突变外，其余均与 2302 号树脂一致；该突变会消除其结合单 ADP 核糖修饰蛋白（MAR）与多 ADP 核糖修饰蛋白（PAR）的能力。阴性对照树脂用于排除非特异性结合干扰，可按需选用。

Af1521 Macrodomain Affinity Resin Set (agarose beads)

所需试剂与材料

实验步骤

1. 轻轻颠倒盛放大分子结构域亲和树脂与阴性对照树脂的储存管数次，重悬树脂，制成均匀的树脂悬液。

2. 使用宽口移液管或剪口吸头吸取 20 微升树脂悬液，加入装有约 1 毫升裂解缓冲液的微量离心管中。

3. 将离心管置于微量离心机内，以 15000 倍重力（最高转速）离心 20 秒使树脂沉淀。小心吸去大部分裂解缓冲液，管底保留沉淀树脂（肉眼仅微弱可见），切勿扰动。注：离心管放置时管盖合页朝外，便于后续定位沉淀树脂位置。

4. 将溶于裂解缓冲液的细胞 / 组织提取液加入装有树脂的微量离心管。推荐提取液总蛋白用量 0.15~1 毫克，缓冲液总体积 0.5 毫升。

5. 将离心管置于旋转混匀仪或同类设备上，4 摄氏度条件下孵育数小时或过夜。

6. 重复步骤 3 的离心操作，使用 0.5~1 毫升裂解缓冲液洗涤树脂，共洗涤 3 次；最后一次洗涤时，轻柔吸净残留缓冲液，避免触碰树脂沉淀。

7. 向每支离心管中加入 75 微升 1 倍浓度SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液，混匀后 95 摄氏度加热 10 分钟，使树脂上结合的GSH S - 转移酶 - 大分子结构域与发生 MAR 修饰、PAR 修饰的蛋白分离。

8. 取处理后的样品进行SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后开展蛋白免疫印迹实验。选用目标蛋白特异性抗体孵育印迹膜以检测亲和纯化蛋白，例如抗聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 1 抗体（货号 #1051）、抗多聚腺苷二磷酸核糖抗体（货号 #1020 或 #1023）。将实验结果与阴性对照树脂样品对比，评估非特异性结合程度，正常情况下非特异性结合应极低。

上海宝叶生物科技有限公司

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