噬菌体展示文库T7活体筛选的特殊步骤

CAS号：3844-53-9中文名称：L-赖氨酸乙酯二盐酸盐其他中文名称：英文名称：H-Lys-OEt•2HCl其他英文名称：L-Lysineethylesterdihydrochloride产品规格：特纯英文名称：H-Lys-OEt·2HCl；L-LysineethylesterdihydrochlorideCAS号：3844-53-9C8H18N2O2·2HC1=247.17的别：Purum含量：≥98.0%熔点：145℃比旋光度：+10±1°（c=2%in...

噬菌体展示文库体外筛选的通用步骤

1．通过腹腔注射浓度为1．25％（w/v）的阿佛丁来麻醉小鼠。2．打开胸腔并暴露心脏。3．用10ml的DMEM或PBS来灌注小鼠。4．连同一个或多个对照器官一起，取出要研究的器官和组织，并将其置于一个直径为30m的细胞培养皿中。5．用无菌刀片将每个器官或组织都切碎。6．将切碎的器官或组织放到2．2m1的无菌塑料管中，并加入1．8m10．5mg/m1的胶原酶。混匀并在37℃摇瓶孵育30分钟。在37℃培养时，持续摇动样品。7．以1500r/min的速率短暂离心细胞悬液5分钟，并弃...

pG6质粒简介，pG6质粒说明

pG6质粒是噬菌体颗粒载体，是为融合蛋白的单价展示设计的。来自辅助噬菌体的野生型pⅥ与噬菌体颗粒载体表达的pⅥ-cDNA的融合蛋白竞争合成原始的噬菌体颗粒。在多链接区域除了有一个额外的SalI位点以外，实际上噬菌体颗粒载体pG6A、pG6B、pG6C与载体pDONG6是等同的，pDONG6允许在gⅥ的3’末端进行eDNA文库克隆。从lac启动子转录可以产生双侧顺反子mRNA：*条顺反子在lacZ和gⅢ3’末端之间编码一个融合蛋白，而第二条顺反子包含了gⅥ-eDNA融合基因。g...

从预制的入GTll文库中制备cDNA插入片段

[方法]A.PCR扩增cDNA插入片段1．在冰浴中将以下成分加到0．2m1微量离心管中（执行10步反应）●水，36．5ul●10×Pfu缓冲液，5．0ul●10mmol/LdNTP，1．5ul●λGTll正向引物（10umol/L），2．5ul●λGTll反向引物（10umol/L），2．5ul●已制备好的Sfi-NotIλGTllcDNA文库，1．Oul●PfuDNA聚合酶（2．5U/ul），1．0ul2．混合反应物并用50ul的矿物油覆盖。3．在95℃下使模板变性2分钟，...

从外周血淋巴细胞（PBls）中分离RNA

[方法]1．收集新鲜人血液并立即用Ficoll分离白细胞。2．用冰冷PBS洗涤外周血淋巴细胞3次。3．在50ml塑料离心管中收集外周血淋巴细胞，并加入7ml裂解缓冲液（可溶解达到5×108个外周血淋巴细胞），然后剧烈涡旋振荡以溶解细胞。4．加入7体积（49m1）4m01/L氯化锂，4℃孵育15～20小时（过夜）。5．将悬液转移到30mlCorex管内，在吊桶式转头内4℃离心2小时，6500r/min。6．弃去上清，并用Kimwipe擦拭试管口。用3mol/L氯化锂（大约15m...

cDNA*链的合成

[方法]1．为合成cDNA*链，在1个1．5ml硅化微量离心管中制备以下反应混合液，●10－RT缓冲液，5ul●20×dNTP，5ul●100mmol/LDTT，5ul●HuIgMFOR引物，2ul●HuCκFOR引物，2ul●HuCλFOR引物，2ul●RNAsin，80U（2ul）●所有引物浓度均为10pmol/ul2．取整数体积（1～4ug）存于乙醇中的RNA，放在1个无菌1．5ml微量离心管内，并用微型离心机离心5分钟。用70%乙醇洗涤沉淀1次，晾干，并用24．5ul...

scFv和载体DNA的连接

[器材和试剂]●T4DNA连接酶及10×缓冲液（NEB）●酚/氯仿（Sigma）●100%和70%乙醇，-20℃保存●消化的载体和scFv文库●TE（10mmol/LTrispH8，lmmol/LEDTA）[方法]1.如下所述，配制两个100ul连接混合液，其中1个用于VH-VκscFv文库，另1个用于Vu-VλscFv文库，并设置两个对照反应。对照可以确定未切的载体有多少（对照2），以及确定无插入序列时有多少重新连接的载体（对照1）。要保持恰当的比例，所获得的克隆数（对于相...

电感受态大肠杆菌TGl的制备

[方法]1．将大肠杆菌TG1种到基本培养琼脂板，37℃过夜。2．将基本培养琼脂板上的大肠杆菌TGl再接种到含有15m12XTY培养基的100ml形瓶中。37℃振荡培养过夜。3．用5ml夜培养的TGl接种到两个含500m12×Y培养基的2L有挡板锥形瓶中。在摇床中培养约1．5小时，直到A600接近0．5。4．将菌液转移4个预冷离心瓶中（约250ml/瓶）。平衡后，置于冰上20分钟。5．以3000g，4℃离心15分钟。使用前预冷所有转头。6，弃去上清，并以起始体积的冰冷lmmol...