在微量滴定板中表达可溶性scFv

[器材和试剂]●用于细菌培养的96孔圆底微量滴定板（Nunc，目录号62162）●含100ug/ml氨苄青霉素和0．1％葡萄糖的2XTY培养基（2×TY/amp/0．1％glu）●含100ug/ml氨苄青霉素和3mmol/LIPTG的2XTY培养基（2×TY/amp/glu/IPTG）（参见实验方案13．10）●噬菌体样品[方法]1．用96孔无菌转移设备或移液器从主板中，每孔取2ul；而后转移至1个每孔含有100ul2×TY/amp/0.1％glu的无菌96孔微量滴定板中。2...

用PCR识别不同的噬菌体抗体克隆

[方法]1．配制PCR“主混合液”，每克隆20ulPCR混合液，包含：●水，15．5ul●10XRT缓冲液，2．0ul●5mmol／LdNTP，1．0ul●5，引物，1．0ul●3，引物，1．0ul●Taq聚合酶，0.2ul如果PCR缓冲液中不含Mg2+，这应加至终浓度为1．5mmol／L。也可以使用与DNA聚合酶配套供应的PCR试剂。2．取20fLl主混合液加到0．5m1管内，或加入96孔PCR微孔板孔内。3．用l根牙签轻轻接触单个克隆并在PCR反应液中转动，注意不要转移太...

再扩增SCFvVLCDR3基因文库

[器材和试剂]●PCR试剂和设备●WinardPCR纯化试剂盒（Promega）●定制的DNA引物●VL—NotI引物（5，—GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGCACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCCGAACACCCAACC—3’）●LMB3引物●用于scFv基因文库限制性消化的试剂和设备●已扩增的scFv基因文库DNA[方法]1．配制4个50ulPCR反应混合液，包含：●去离子水，35．5ul●20×dNTP（每种5mmol/L），2．5u...

连接scFv和载体DNA并转化大肠杆菌

[器材和试剂]●去离子水（millipore）●T4DNA连接酶和10×连接酶缓冲液（NEB）●16℃水浴●消化的scFv文库DNA●pHENlDNA，用NcoI和NotI消化（100ng／ul）●电感受态大肠杆菌TGl细胞（Strataeene）●用于将scFv文库电转化到大肠杆菌TGl株的试剂和设备[方法]1．配制1个50ul连接混合液，包含：●10×连接缓冲液，5uI●水，16ul●NcoI和NotI消化的pHENl（100g／ul），20ul●VcoI和NotI消化的...

平衡法选择高亲和力噬菌体抗体

1．多样化的噬菌体抗体丈库中制备噬菌体抗体。2．根据厂家说明，对抗原进行生物素化。3．选择前，在1个1．5m1微量离心管中．用2％MPBS1m1封闭150ul链霉亲和素磁珠，室温1小时。用磁性试管架将碰珠吸向一侧。弃去缓冲液。4．用2％MPBS封闭3个1．5m1微量离心管，室温1小时；而后，弃去封闭缓冲液。以3个不同浓度将士物素化抗原（总共3管）与溶于2％MPDS（终浓度）的1m1噬茼体样品（大约1012c{u／m1）进行孵育，室温振荡l小时。对于*轮选择，抗原浓度应分别为K...

用Biacore仪筛选解离速率较低的scFv

选择3～5轮后，随机挑取克隆加入96孔微量滴定板中并诱导表达可溶性scFv。然后，在包被有相关抗原的96孔微量滴定板中，用ELISA分析含有可溶性scFv的细菌上清。此过程可以识别出那些结合了抗原的scFv。但即便采用上述严谨性选择后，ELISA阳性克隆中仅有部分克隆的亲和力比野生型高。ELISA信号强度不能很好地显示哪个克隆具有较低的Ka值，而且更为普遍的是它与scFv表达水平相关。因此，这就需要一种筛选ELISA阳性克隆的技术，能识别出具有较低Ka值的克隆。竞争性或抑制性...

鞣酸—柠檬酸钠还原法制备胶体金分散颗粒

A液（80ml）：1％氯化金，lml；双重蒸馏水，79ml。B液（20m1）：1％柠檬酸钠，4ml；1％单宁酸，0.lml；双重蒸馏水，15．8ml。25mmol/LK2C03，0．1ml；将上述A液加热到60℃，然后将B液快速加入到A液中，继续搅拌，在极短的时间内加热到煮沸（大约10min），此时颜色由黑一蓝一亮红（近似红葡萄酒颜色）变化。pH调到所需要求（根据所标记蛋白质种类的不同，所需的pH也不一样）。上述用量合成的胶体金为10nm，根据所加入鞣酸（或称单宁酸）量的不同...

制备胶体金分散颗粒的其他方法

乙醇—超声波还原法（Baigent和Muller，1980）（1）取1％AuCl3·HCl水溶液lml加入100ml双重蒸馏水。（2）用0．2m01/LK2C03调pH至7．2，再加入lml无水乙醇。（3）用20KC、135W超声波探头浸入溶液内进行超声振荡，此法制备的颗粒为6～10nm。硼氢化钠还原法（Tschopp等，1982）（1）取0．6ml1％氯化金水溶液，加入40ml预冷（4℃）双蒸馏水。（2）再加入0．2mol/LK2C030．2ml。（3）边搅拌边加入新鲜配制...